基因診斷與性病/尖銳濕疣
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尖銳濕疣（condylomaacuminatum,CA）又名性疣（Venereal warts)、肛門生殖器疣(anogenital warts)，祖國醫(yī)學(xué)稱之為“瘙瘊”，俗稱“臊瘊”，是由人類乳頭瘤病毒（HPV）感染所致的生殖器、會(huì)陰和肛門部位的表皮瘤樣增生。由于性接觸感染者屬性病范疇。本病發(fā)病率高。我國的發(fā)病率近年來亦有不斷增長的趨勢(shì)。本病在性傳播疾病中，占15.7%，病例數(shù)占第三位，在性傳播疾病中，本病增長最快。由于本病與生殖器、肛門癌有關(guān)，加之亞臨床感染增多，易于復(fù)發(fā)，已引起人們的廣泛重視。
目錄 |
第一節(jié) 病原學(xué)
HPV在皮膚上引起疣贅、在咽部、肛周、生殖器粘膜上形成增殖性病變，其病毒型為小型DNA病毒。感染HPV發(fā)生病變多數(shù)屬于良性，能自行消退，但也有惡化病例。如肛周、生殖器粘膜上形成扁平上皮癌的報(bào)道。還有罕見的遺傳性皮膚疾患、疣贅狀表皮發(fā)育異常癥（EV）續(xù)發(fā)的皮膚癌等，在癌細(xì)胞中檢出HPV。
HPV為乳多空病毒科A屬成員，病毒顆粒直徑50-55nm無被膜的正20面體構(gòu)成的病毒殼體，具有7900堿基對(duì)的環(huán)狀雙鏈DNA組成，電鏡下病毒顆粒的大小、形態(tài)與口多瘤病毒極為相似。乳頭瘤病毒（PV）具有種屬特異性，HPV尚未能在組織培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型中繁殖。
病毒的結(jié)構(gòu)蛋白組成：85%的PV顆粒，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS——PAGE）可確定病毒有主要衣殼蛋白、分子量為56.000；次要衣殼蛋白，分子量遷移于76.000處，發(fā)現(xiàn)4種細(xì)胞組蛋白與病毒DNA相關(guān)。
所有HPV病毒的基因組結(jié)構(gòu)相似，根據(jù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行DNA雜交的程序可確定病毒的型和亞型，不同的HPV型DNA與其他類型病毒DNA僅50%出現(xiàn)交叉雜交，迄今已發(fā)現(xiàn)60多種HPV類型，隨著研究的深入，將會(huì)鑒定出更多HPV新的類型。
第二節(jié) HPV的基因結(jié)構(gòu)
HPV的基因組是雙鏈閉環(huán)DNA，其長度為7200-8000bp，分子量約5.2×10KDa。一般說來，HPV基因組可以分為3個(gè)區(qū)段：早期區(qū)、晚期區(qū)及上游調(diào)節(jié)區(qū)（URR）或長控制區(qū)（LCR）或非編碼區(qū)（NCR）。早期區(qū)與晚期區(qū)約有10個(gè)主要開放讀碼框架（ORF），約占基因組的60%，均在雙鏈DNA的一條鏈上編碼，早期區(qū)約占4Kb，編碼5-8個(gè)開放閱讀框架，依次為E6、E7、E1（E8）、E2 、E4 （E3 ）、E5 ，早期區(qū)的功能涉及DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及細(xì)胞轉(zhuǎn)化，晚期區(qū)也稱L區(qū)，約3000bp，有兩個(gè)主要ORF，分別稱為L1，L2，編碼病毒自身結(jié)構(gòu)蛋白，與E區(qū)的轉(zhuǎn)錄方向一致。非編碼區(qū)即URR區(qū)，位于L1和E6之間，長約1000bp，含有一些AT豐富區(qū)，含有內(nèi)含子，增強(qiáng)子序列。HPV-16在URR區(qū)保守序列為TTTGGCTT，這也是角朊細(xì)胞依賴性增強(qiáng)子的一部分，與HPV的表皮向性有關(guān)，此外，其還可能使HPV-16DNA 以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在于癌細(xì)胞中。
（一）早期轉(zhuǎn)錄及早期蛋白
E1ORF3′端變異可以使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，并使DNA呈整合狀態(tài)，游離DNA復(fù)制的能力可被另一DNA上的野生型E1ORF所互補(bǔ)，這就表明變異區(qū)具有一種反式作用的功能。E1ORF5′端具有游離DNA復(fù)制的負(fù)調(diào)節(jié)功能，此外E1蛋白的一個(gè)區(qū)段在氨基酸水平與SV40大T抗原有較強(qiáng)的同源性，這一區(qū)域位于E1蛋白C端的1/2，而大T抗原參與核苷酸結(jié)合，并具有ATP酶活性因此提示E1參與病毒DNA的復(fù)制。E2ORF編碼一種早期區(qū)的反式激活因子，后者又可能作用于URR區(qū)，而同一E2ORF的3′端編碼一種可抑制上述反式激活因子的蛋白,所以E2ORF編碼著2個(gè)在功能上相拮抗的蛋白。E7ORF含有一個(gè)轉(zhuǎn)化基因，可以使大鼠血管3Y1細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，E7尚與調(diào)節(jié)基因拷貝數(shù)有關(guān)。
（二）晚期轉(zhuǎn)錄及晚期蛋白
晚期區(qū)編碼L1和L2蛋白，L1是主要的核殼蛋白，L1的抗體可與成熟病毒的核衣殼相作用，L2的作用則尚未明晰，可能是次要的核蛋白，而且可能與病毒的宿主選擇性有關(guān)。晚期蛋白的多聚腺苷酸信號(hào)位于L1ORF之后。
URR區(qū)：是乳頭瘤病毒基因組中變異較大的一個(gè)區(qū)段，甚至在密切相關(guān)的型別之間也有差異。所有型別的HPV在URR區(qū)段中都含有重復(fù)序列，可增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響病毒的致病力。
第三節(jié) 流行病學(xué)
一、流行情況
尖銳濕疣為人類乳頭瘤病毒所引起。目前一致認(rèn)為此病在增多，成為STDS中的最常見疾病，在年輕成人中患病率可達(dá)0.5%-1%。英國尖銳濕疣發(fā)病率從1970年的30/10萬增到1988年的260/10萬，幾乎增加了8倍，美國此病發(fā)病率從1966年到1984年增加了6倍。和艾滋病相似，有癥狀的尖銳濕疣僅代表感染者的“冰山”之頂，所以如考慮亞臨床感染在內(nèi)，人類乳頭瘤病毒感染可能是發(fā)病率占第一位的性病。此感染的傳播方式包括直接與間接傳播，但以性接觸最為常見，而且越是近期損害越有傳染性，一次性接觸估計(jì)有50%被傳染的可能性；其次為直接非性接觸，如自體傳染以及新生兒經(jīng)產(chǎn)道受染；再其次為間接接觸，通過污染傳染、推測(cè)有可能，但因此病病毒尚不能培養(yǎng)，未能證實(shí)。
二、尖銳濕疣發(fā)生的危險(xiǎn)因素
（一）性行為：性伴數(shù)及過早性交是造成發(fā)生HPV感染的因素。
（二）免疫抑制：HPV感染和與HPV有關(guān)的癌似乎是慢性免疫功能抑制的晚期并發(fā)癥。腎異體移植者中患CA的危險(xiǎn)性增加。
（三）HIV感染：HIV陽性發(fā)生HPV感染及HPV相關(guān)腫瘤的機(jī)率增加。
（四）年齡，妊娠：在婦科涂片中檢測(cè)HPV高峰流行率的年齡為20-40歲，隨著年齡增加，流行率穩(wěn)步下降；妊娠期間的HPV檢出率高，產(chǎn)后HPV檢出率下降。
第四節(jié) 免疫學(xué)
宿主對(duì)HPV感染引起的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞免疫與體液免疫兩個(gè)方面。
一、細(xì)胞免疫
人體細(xì)胞免疫狀態(tài)是影響CA發(fā)生、轉(zhuǎn)歸的重要基礎(chǔ)之一。細(xì)胞免疫比體液免疫更為重要。臨床上伴細(xì)胞免疫缺陷的尖銳濕疣患者皮疹常持續(xù)不退，其外周血中抑制性T細(xì)胞數(shù)增多NK細(xì)胞功能低下，r-干擾素和白細(xì)胞介素2產(chǎn)生減少，而消退疣皮損中常常出現(xiàn)活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞的浸潤，部分角朊細(xì)胞HLA-DR陽性。
免疫抑制或免疫缺陷時(shí)，生殖器HPV感染和HPV相關(guān)疾病的發(fā)生率均增加。尖銳濕疣中輔助性T細(xì)胞耗竭，CD4/CD8比值倒置，其值＜1。在CA病人的外周血中，發(fā)現(xiàn)抑制/細(xì)胞毒性T細(xì)胞百分率顯著增高，輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞的比值和輔助/抑制T細(xì)胞比值均降低。宮頸CA和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）病損中朗格罕細(xì)胞明顯減少。CA中NK細(xì)胞產(chǎn)生r-干擾素和白介素-2減少。鮑溫樣丘疹病和肛門生殖器癌者中NK細(xì)胞對(duì)含有HPV-16的角朊細(xì)胞的溶解活性下降，可能是對(duì)疾病特異性靶細(xì)胞的識(shí)別缺陷所致，宮頸CA的角朊細(xì)胞不表達(dá)MHCⅡ型抗原(HLA-DR)，無此抗原提呈功能可以破壞免疫監(jiān)視作用。
二、體液免疫
目前血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：①抗晚期蛋白抗體產(chǎn)生率為25%-65%，較抗早期蛋白抗體產(chǎn)生率高；②檢測(cè)出的HPV抗體似有型特異性，無交叉反應(yīng)；③抗HPV-16E7抗體與宮頸癌的存在有密切關(guān)系；④抗HPV-16E4抗體也是發(fā)生宮頸癌、復(fù)發(fā)或近期HPV感染的標(biāo)志；⑤估計(jì)成人和兒童產(chǎn)生IgG抗體的陽性率相同，不同型別陽性率在10%-75%之間；⑥已證明HPV-16或18型腫瘤抗體陽性患者中，僅50%-70%可檢出該抗體。
三、尖銳濕疣自然消退
對(duì)CA自然消退尚無系統(tǒng)評(píng)估，然而以安慰劑對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)其自然消退率在0%，17%、18%和69%之間，CA消退或治愈后，仍有45%患者存在潛伏感染，其中67%患者復(fù)發(fā)。
第五節(jié) 發(fā)病機(jī)理
尖銳濕疣的HPV感染通過性接觸傳播，接觸部位的小創(chuàng)傷可促進(jìn)感染，三種鱗狀上皮（皮膚、粘膜、化生的）對(duì)HPV感染都敏感。每一型HPV與特殊的臨床損害有關(guān)，且對(duì)皮膚或粘膜鱗狀上皮各有其好發(fā)部位。當(dāng)含有比較大量病毒顆粒的脫落表層細(xì)胞或角蛋白碎片進(jìn)入易感上皮裂隙中時(shí)，感染就可能產(chǎn)生，它可因直接接觸或少見的自動(dòng)接種或經(jīng)污染的內(nèi)褲、浴盆、浴巾、便盆感染。
病毒感染人體后，可潛伏在基底角朊細(xì)胞間，在表皮細(xì)胞層復(fù)制，HPV侵入細(xì)胞核，引起細(xì)胞迅速分裂，同時(shí)伴隨病毒顆粒的繁殖與播散，形成特征性的乳頭瘤。晚期基因表達(dá)結(jié)構(gòu)多肽，即出現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白裝配顆粒，病毒主要集中在顆粒層中的細(xì)胞核內(nèi)，在表皮的顆粒層出現(xiàn)凹空細(xì)胞增多，組織學(xué)上正常的上皮細(xì)胞也有HPV，治療后殘余的DNA?？蓪?dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)。
第六節(jié) 臨床表現(xiàn)
潛伏期3周到8個(gè)月，平均3個(gè)月，多見于性活躍的青、中年男女，發(fā)病高峰年齡為20-25歲，病程平均在3-5個(gè)月的男女患者，在性接觸后不久即發(fā)病，而病程平均12個(gè)月的男性患者，其性接觸者可不發(fā)病。多數(shù)患者一般無癥狀。損害大小及形狀不等?？蓛H為數(shù)個(gè)，亦可為多數(shù)針頭樣大的損害：在陰肛部可長成大的腫瘤樣物，有壓迫感；有惡臭味；有時(shí)小的濕疣可出現(xiàn)陰部痛癢不適，病人可出現(xiàn)尿血和排尿困難；直腸內(nèi)尖銳濕疣可發(fā)生疼痛、便血，而直腸內(nèi)大的濕疣則可引起里急后重感。
男性患者好發(fā)于包皮系帶、冠狀溝、包皮、尿道、陰莖、肛門周圍和陰囊。病初為淡紅或污紅色粟狀大小贅生物，性質(zhì)柔軟，頂端稍尖，逐漸長大或增多?？砂l(fā)展成乳頭狀或囊狀，基底稍寬或有帶，表面有顆粒。在肛門部常增大，狀如菜花，表面濕潤或有出血，在顆粒間常積存有膿液，散發(fā)惡臭氣味，搔抓后可繼發(fā)感染。位于濕度較低干燥部位的生殖器疣，損害常小而呈扁平疣狀。位于濕熱濕潤部位的疣常表現(xiàn)為絲狀或乳頭瘤狀，易融合成大的團(tuán)塊。有嚴(yán)重肝病的患者濕疣可增大。妊娠可使?jié)耩鄰?fù)發(fā)或生長加快。
亞臨床感染是指臨床上肉眼不能辨認(rèn)的病變，但用3%-5%醋酸液局部外涂或濕敷5-10分鐘可在HPV感染區(qū)域發(fā)白，即所謂“醋酸白現(xiàn)象”。
HPV感染和腫瘤的發(fā)生：
（一）HPV與皮膚腫瘤的發(fā)生有關(guān)
它在皮膚癌和其他解剖部位的腫瘤似乎起決定作用。口腔良性贅生物和癌前病變，皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中可發(fā)現(xiàn)HPV-11、16、18型DNA，曾報(bào)道喉部HPV-6乳頭瘤惡變成喉癌，皮膚疣狀表皮發(fā)育不良（EV）是HPV潛在致癌作用的證據(jù)，EV皮損中發(fā)現(xiàn)多種HPV型DNA，并在患者皮膚鱗狀細(xì)胞癌中檢出HPV-5、8、14、17及20型，皮膚鱗狀細(xì)胞癌似乎是由先已存在的病毒性損害惡變而來。
（二）尖銳濕疣與肛門生殖器癌
生殖器癌與HPV類型有一定的關(guān)系。利用DNA雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)生殖器癌組織中存在HPV-6、11、16、18型等。
1．宮頸癌：根據(jù)HPV與宮頸癌的關(guān)系，可將其分為兩大類型：低危型主要指HPV-6、11型，高危型是指HPV-16、18型，Gissmann等觀察到在侵襲性宮頸癌中，有57.4%患者存在著HPV-16、18型，其他學(xué)者也有相同發(fā)現(xiàn)。還有人從侵襲性宮頸癌中分離出HPV-33和35型。
2．皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）：HPV感染而發(fā)生的CA也可能是癌前損害，并可發(fā)展成肛門生殖器SCC，這表明HPV是女陰、陰莖及肛門生殖器SCC的重要因素。CA，巨大CA和疣狀SCC組成一個(gè)生殖器癌前病變和癌的損害病譜，有些部位生殖器癌病例在其周圍皮膚有CA存在，有時(shí)肉眼見為典型的CA，但組織學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)SCC的孤立病灶。
3．鮑溫樣丘疹?。撼Ｒ娪陉幥o、女陰或肛門周圍，曾在皮損內(nèi)發(fā)現(xiàn)HPV-16型DNA。
第七節(jié) 實(shí)驗(yàn)室檢查
用3-5%醋酸外涂疣體2-5分鐘，病灶部位變白稍隆起，肛門病損可能需要15分鐘。本試驗(yàn)的原理是蛋白質(zhì)與酸凝固變白的結(jié)果，HPV感染細(xì)胞產(chǎn)生的角蛋白與正常的未感染上皮細(xì)胞產(chǎn)生的不同，只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗(yàn)檢測(cè)HPV的敏感性很高，它比常規(guī)檢測(cè)觀察組織學(xué)變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現(xiàn)假陽性、假陽性變白跡象顯得界限不清和不規(guī)則。美國CDC提示，醋酸白試驗(yàn)并不是特異試驗(yàn)，且假陽性較常見。
二、免疫組織學(xué)檢查
常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法（即PAP），顯示濕疣內(nèi)的病毒蛋白，以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽性時(shí)，尖銳濕疣的淺表上皮細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)淡紅色的弱陽性反應(yīng)。
三、組織化學(xué)檢查
取少量病損組織制成涂片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結(jié)合。在過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成紅色。此法特異性強(qiáng)且較迅速，對(duì)診斷有幫助。
四、病理檢查
主要為角化不全，棘層高度肥厚，乳頭瘤樣增生，表皮突增厚，延長，其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細(xì)胞和基底細(xì)胞并有相當(dāng)數(shù)量的核分裂、頗似癌變。但細(xì)胞排列規(guī)則，且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點(diǎn)為粒層和刺層上部細(xì)胞有明顯的空泡形成。此種空泡細(xì)胞較正常大，胞漿著色淡、中央有大而圓，深嗜堿性的核。通常真皮水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張以及周圍較致密的慢性炎性浸潤。Bushke-loewenstein巨大型尖銳濕疣，表皮極度向下生長，代替了其下面的組織、易與鱗狀細(xì)胞相混，故須多次活檢。若有緩慢發(fā)展之傾向，則為一種低度惡變的過程，即所謂疣狀癌。
五、基因診斷
迄今，HPV難于用傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)及血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)，主要實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)是核酸雜交。近年來發(fā)展的PCR方法具有特異、敏感、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，為HPV檢測(cè)開辟了新途徑。
（一）標(biāo)本的采集及處理
1．標(biāo)本的采集和預(yù)處理：用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細(xì)胞。在作細(xì)胞學(xué)檢查的同時(shí)，將標(biāo)本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS離心（3000g，10min）洗滌2次，沉積細(xì)胞重懸于1mlPBS中，取0.5ml細(xì)胞懸液抽提DNA。
2．標(biāo)本核酸的提?。喊?體積細(xì)胞懸液加10倍體積的細(xì)胞裂解液（10mmol/l Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿(1:1)，氯仿/異戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10體積3mol/l NaAc（pH5.2）及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉淀DNA；加1體積乙醇洗滌1次；用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/l Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)溶解DNA，37℃溫育30min。
（二）PCR擴(kuò)增
1．引物設(shè)計(jì)和合成：HPV基因組可分為早期區(qū)（E）和晚期區(qū)（L），每區(qū)含一系列開放讀碼框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非編碼區(qū)及E1、E6、E7和L1區(qū)均有保守序列。Manos等從HPVL1區(qū)中選擇保守序列設(shè)計(jì)合成引物MY11和MY09見表1，該引物與HPv 6、11、16、18及33型有互補(bǔ)序列，也可擴(kuò)增其它型HPV。
Manos等設(shè)計(jì)的HPVL1通用引物
MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG
MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC
表1
| HPV型 | MY11的第1個(gè)鹼基位置 | MY09的第1個(gè)鹼基位置 | PCR產(chǎn)物長度（bp） |
| 6 | 6722 | 7170 | 448 |
| 11 | 6707 | 7155 | 448 |
| 16 | 6584 | 7035 | 451 |
| 18 | 6558 | 7012 | 454 |
| 33 | 6539 | 6987 | 448 |
M=A+C， R=A+G，W=A+T，Y= C+T
表2列述了Manos等設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針。公用混合探針序列選自HPVL1區(qū)中另一保守序列，可與 MY11和MY09引物產(chǎn)生的多種HPVL1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交：型特異探針只與相應(yīng)HPV型有互補(bǔ)序列，用于檢出的HPV分型。
表2 Manos等設(shè)計(jì)的HPVL1PCR產(chǎn)物探針
| 公用混合探針 | |||
| GP1 CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC | |||
| GP2 CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC | |||
| 第一個(gè)鹼基位置 | |||
| HPV6 6771 HPV11 6757 HPV16 6631 | |||
| HPV18 6607 HPV33 6588 | |||
| 型特異探針 | |||
| 探針 | HPV型 | 序列 | 基因位置 |
| MY12 | HPV6 | CATCCGTAACTACATCTTCCA | 6813—6833 |
| MY13 | HPV11 | TCTGTGTCTAAATCTGCTACA | 6800—6820 |
| MY14 | HPV16 | CATACACCTCCAGCACCTAA | 6926—6945 |
| MY74 | HPV18 | GGATGCTGCACCGGTCTGA | 6905—6922 |
| MY16 | HPV33 | CACACAAGTAACTAGCTACAG | 6628—6648 |
H=A+C+T，R=A+G，W=A+T，Y=C+T
2．PCR反應(yīng)試劑：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/l dNTP貯備液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR緩沖液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100μmol/L MY11和MY09貯備液，滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。
3．PCR擴(kuò)增方法和程序：以100μlPCR反應(yīng)液,用無菌0.5ml硅化塑料離心管為反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
（1）實(shí)驗(yàn)前配制預(yù)混反應(yīng)試劑并分裝。預(yù)混反應(yīng)試劑包括除標(biāo)本DNA外的其它各種PCR反應(yīng)試劑。每支反應(yīng)管中含有的PCR反應(yīng)試劑見表3。
表3每支反應(yīng)管中的PCR反應(yīng)試劑
| 反應(yīng)試劑 | 體積（μl） | 終濃度 |
| 10×PCR緩沖液 | 10 | 1×PCR緩沖液 |
| dNTP貯備液 | 2 | 200μmol/L每種dNTP |
| MY11貯備液 | 0.5 | 500μmol/L |
| MY09貯備液 | 0.5 | 500μmol/L |
| Taq DNA聚合酶 | 0.5 | 2.5μ |
| 滅菌蒸餾水 | 75.5 | |
| 總計(jì) | 90.0 |
（2）各反應(yīng)管依次加入10μl標(biāo)本和90μl預(yù)混反應(yīng)試劑。
（3）加入80-100μl石蠟油，在臺(tái)式離心機(jī)上快速離心數(shù)秒鐘，使各反應(yīng)試劑收集于油層下。目前，PCR試劑已商品化，反應(yīng)體積為25μl。使用時(shí)只加入標(biāo)本DNA即可。
（4）將反應(yīng)管置PCR擴(kuò)增儀上，循環(huán)參數(shù)為95℃30s，55℃ 40s，72℃ 50s循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。
4．每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性及陰性對(duì)照。以載有HPV的重組質(zhì)粒（每反應(yīng)為100pg）或含有HPV的細(xì)胞系（如Caski、HeLa）DNA為陽性對(duì)照，以無HPV的人細(xì)胞系DNA為陰性對(duì)照。
（三）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和分析
1．凝膠電泳：擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，冷卻至室溫，取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀下分析結(jié)果，分子量約為450bp處出現(xiàn)明顯的DNA帶。
2．核酸雜交：如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時(shí)，可用標(biāo)記的公用混合探針和（或）型特異探針作Southern吸印雜交、斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法制32p ATP標(biāo)記的寡核苷酸探針，需達(dá)到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml。在55℃緩慢振蕩下雜交2-3h，隨后于30-55℃下用洗滌液（2×SSC、0.1%SDS）迅速?zèng)_洗雜交膜，除去多余探針。然后進(jìn)行洗膜，其條件依所用探針而異：公用混合探針，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探針，56-57℃下10min，并換液重洗1次；MY14及WD74探針，58-59℃下10min，亦換液重洗1次。
用PCR方法檢測(cè)HPV比核酸雜交方法優(yōu)越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結(jié)果，可檢出標(biāo)本中200個(gè)拷貝的HPv DNA，若以核酸雜交檢測(cè)PCR產(chǎn)物，敏感性提高，能檢出10個(gè)拷貝的HPv DNA。
鑒于PCR技術(shù)的高度敏感性，以生殖道脫落細(xì)胞為檢材足以滿足試驗(yàn)要求，避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，觀察產(chǎn)生的DNA可直接作出診斷。因此，PCR技術(shù)檢測(cè)HPV實(shí)驗(yàn)周期短、簡(jiǎn)便快速。
第八節(jié) 診斷及鑒別診斷
一、診斷
1．不潔性交史。
2．典型皮損為生殖器或肛周等潮濕部位出現(xiàn)丘疹，乳頭狀、菜花狀或雞冠狀肉質(zhì)贅生物，表面粗糙角化。
3．醋酸白試驗(yàn)陽性，病理切片可見角化不良及凹空細(xì)胞。
4．
二、鑒別診斷
1．生殖器鱗癌；多見于40歲以上或老年人，皮損向下浸潤，發(fā)生潰瘍，組織病理有特征性改變。
2．扁平濕疣：為多個(gè)濕丘疹融合成片狀的皮損，多見于肛周，皮損處可查到梅毒螺旋體，梅毒血清試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)。
3．珍珠狀陰莖丘疹病：為沿冠狀溝排列，針頭及粟粒大小的皮色或淡粉紅色丘疹。組織病理無凹空細(xì)胞。
4．假性濕疣；損害為局限于小陰唇的粟粒大呈魚卵狀淡紅色小丘疹或絨毛狀改變，皮損表面光滑，醋酸白試驗(yàn)陰性，病理上無具有診斷意義的凹空細(xì)胞。
5．鮑溫樣丘疹??；為棕紅色或色素性小丘疹，組織病理可見異型鱗狀細(xì)胞及類似原位癌的組織象。
第九節(jié) 治療
由于目前沒有特效的抗病毒藥物，尖銳濕疣的治療必須采用綜合治療。
（二）提高機(jī)體免疫力。
（三）應(yīng)用抗病藥物。一般只要堅(jiān)持規(guī)則的綜合治療都可治愈。
1．手術(shù)療法
對(duì)于單發(fā)、面積小的濕疣，可手術(shù)切除；對(duì)巨大尖銳濕疣，可用Mohs氏手術(shù)切除，手術(shù)時(shí)用冷凍切片檢查損害是否切除干凈。
2．冷凍療法
利用-196℃低溫的液體氮，采用壓凍法治療尖銳濕疣，促進(jìn)疣組織壞死脫落，本法適用于數(shù)量少，面積小的濕疣，可行1-2次治療，間隔時(shí)間為一周。
3．激光治療
通常用CO2激光，采用燒灼法治療尖銳濕疣，本療法最適用女陰、陰莖或肛周的濕疣。對(duì)單發(fā)或少量多發(fā)濕疣可行一次性治療，對(duì)多發(fā)或面積大的濕疣可行2-3次治療，間隔時(shí)間一般為一周。
4．電灼治療
采用高頻電針或電刀切除濕疣。方法：局部麻醉，然后電灼，本療法適應(yīng)數(shù)量少，面積小的濕疣。
5． 微波治療
采用微波手術(shù)治療機(jī)，利多卡因局麻，將桿狀輻射探頭尖端插入尖銳濕直達(dá)疣體基底，當(dāng)看到就體變小、顏色變暗、由軟變硬時(shí)，則熱輻射凝固完成，即可抽出探頭。凝固的病灶可以用鑷子挾除。為防止復(fù)發(fā)，可對(duì)殘存的基底部重復(fù)凝固一次。
6． β-射線治療
我們應(yīng)用β-射線治療尖銳濕疣取得了較為滿意的效果，該方法療效高，無痛苦、無損傷、副作用少，復(fù)發(fā)率低，在臨床上有推廣價(jià)值。
7． 藥物療法
（1）足葉草脂：本療法適用濕潤區(qū)域的濕疣，例如發(fā)生于包皮過長而未曾作包皮環(huán)切除手術(shù)的龜頭及會(huì)陰部的濕疣。但對(duì)宮頸尖銳濕疣不能用足葉草脂治療。用20%足葉草脂酊劑涂到皮損處或用藥前，先有油質(zhì)抗菌藥膏保護(hù)皮損周圍的正常皮膚或粘膜，然后涂藥，用后4-6小時(shí)，用30%硼酸水或肥皂水清洗，必要時(shí)3天后重復(fù)用藥，該藥是國外用于本病治療的首先藥，一般用一次可愈。但有很多缺點(diǎn)，如對(duì)組織破壞性大，使用不當(dāng)可引起局部潰瘍。毒性大，主要表現(xiàn)為惡心、腸梗阻、白細(xì)胞及血小板減少，心動(dòng)過速、尿閉或少尿，故使用時(shí)必須謹(jǐn)慎，發(fā)現(xiàn)上述反應(yīng)時(shí)，應(yīng)立即停藥。
（2）抗病毒藥：可用5%酞丁胺霜?jiǎng)蛴?.25%皰疹凈軟膏，每日2次，外涂。無環(huán)鳥苷口服，每日5次，每次mg，或用其軟膏外用，α-干擾素每日注射300萬單位,每周用藥五天?；蚋蓴_素300萬單位注入疣體基部，每周2次。連用2-3周，主要副作用為流感樣綜合癥，局部用藥副作用較少且輕微。
（3）腐蝕劑或消毒劑：常用有30%-50%三氯醋酸或飽和二氯醋酸，或18%過氧乙酸。用10%水楊酸冰醋酸或40%甲醛、2%液化酚、75%乙醇蒸餾水100ml混合溶液，點(diǎn)涂局部，用于龜頭、肛周濕疣，每日或隔日一次，效果甚好。消毒劑可用20%碘酊外涂，或2.5-5%碘酊注射于疣體基部，每次-1.5ml，或用新潔爾滅外涂或以0.1-0.2%外敷，后者需配合全身療法。
（4）抗癌藥
① 5-氟脲嘧啶(5-F u)：一般外用5%軟膏或霜?jiǎng)?，每?次，3周為一療程。2.5%~5%氟脲嘧啶濕敷治療陰莖、肛周尖銳濕疣，每次敷20分鐘，每日一次，6次為一療程。也可用聚乙二醇作基質(zhì)，加入占其干質(zhì)5%的5-F u粉劑制成栓劑，治療男女尿道內(nèi)尖銳濕疣，也可用5- F u基底注射，多者可分批注射。
② 噻替哌：主要用于5-F u治療失敗的尿道內(nèi)尖銳濕疣，每日用栓劑（每個(gè)含15mg），連用8天，也可將本品60mg加入10-15ml消毒水中，每周向尿道內(nèi)滴注，保持半小時(shí)，副作用有尿道炎。亦可用本品10mg加入10ml浸泡患處，每日3次，每次半小時(shí)，治療陰莖、龜頭冠狀溝濕疣，主要用于經(jīng)其它方法治療后，尚有殘存疣體或復(fù)發(fā)者。也可將此溶液再稀釋兩倍浸泡局部，以預(yù)防復(fù)發(fā)。
③ 秋水仙鹼：可用2-8%的生理鹽水溶液外涂，涂?jī)纱危g隔72小時(shí)治療陰莖濕疣，涂后可出現(xiàn)表淺糜爛。
④ 爭(zhēng)光霉素或平陽霉素：用0.1%的生理鹽水溶液作皮損內(nèi)注射，每次總量限制在1毫升（1mg），大多一次可愈。平陽霉素為爭(zhēng)光霉素?fù)Q代品，用法基本相同，亦有用平陽霉素10mg溶于10%普魯卡因20ml內(nèi)注射。
8．免疫療法
① 自體疫苗法:用病人自己的疣體組織勻漿(融冷滅活病毒)，并進(jìn)行加熱處理（56℃一小時(shí)）收集上清液注射，可用于頑固性肛周濕疣。
②干擾素誘導(dǎo)劑：可用聚肌胞及梯洛龍。聚肌胞每日注射2 ml，連用10天，停藥1-2月后，再繼續(xù)用藥。梯洛龍每日3次，每次mg，停藥4天，或隔日口服600 mg。
③ 干擾素、白介Ⅱ，靈桿菌素，利百聯(lián)合應(yīng)用，療效較佳。
第十節(jié) 預(yù)防
控制性病是預(yù)防CA的最好方法。發(fā)現(xiàn)治療患者及其性伴；進(jìn)行衛(wèi)生宣教和性行為的控制；陰莖套具有預(yù)防HPV感染的作用，目前尚無有效疫苗。
參看
 艾滋病預(yù)防 | 生殖器皰疹  |
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