核小體
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核小體的形狀類似一個(gè)扁平的碟子或一個(gè)圓柱體，直徑為11nm，高6nm。染色質(zhì)就是由一連串的核小體所組成。當(dāng)一連串核小體呈螺旋狀排列構(gòu)成纖絲狀時(shí)，DNA的壓縮包裝比約為40。纖絲本身再進(jìn)一步壓縮后，成為常染色質(zhì)的狀態(tài)時(shí)，DNA的壓縮包裝比約為1000。有絲分裂時(shí)染色質(zhì)進(jìn)一步壓縮為染色體，壓縮包裝比高達(dá)10000，即只有伸展?fàn)顟B(tài)時(shí)長(zhǎng)度的萬(wàn)分之一。
目錄 |
定義
核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，由DNA和組蛋白(histone)構(gòu)成，是染色質(zhì)（染色體）的基本結(jié)構(gòu)單位。由4種組蛋白H2A、H2B、H3和H4， 每一種組蛋白各二個(gè)分子，形成一個(gè)組蛋白八聚體，約200 bp的DNA分子盤繞在組蛋白八聚體構(gòu)成的核心結(jié)構(gòu)外面，形成了一個(gè)核小體。這時(shí)染色質(zhì)的壓縮包裝 比(packing ratio)為6左右，即DNA由伸展?fàn)顟B(tài)壓縮了近6倍。200 bpDNA為平均長(zhǎng)度；不同組織、不同類型的細(xì)胞，以及同一細(xì)胞里染色體的不同區(qū)段中，盤繞在組蛋白八聚體核心外面的DNA長(zhǎng)度是不同的。如真菌的可以短到只有154 bp，而海膽精子的可以長(zhǎng)達(dá)260bp，但一般的變動(dòng)范圍在180bp到200bp之間。在這 200bp中，146 bp是直接盤繞在組蛋白八聚體核心外面，這些DNA不易被核酸酶消化，其余的DNA是用于連接下一個(gè)核小體。連接相鄰2個(gè)核小體的DNA分子上結(jié)合了另一種組蛋白H1。組蛋白H1包含了一組密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，其數(shù)量相當(dāng)于核心組蛋白的一半，所以很容易從染色質(zhì)中抽提出來(lái)。所有的H1被除去后 也不會(huì)影響到核小體的結(jié)構(gòu)，這表明H1是位于蛋白質(zhì)核心之外的?！ ?/p>
形狀
核小體的形狀類似一個(gè)扁平的碟子或一個(gè)圓柱體，直徑為11 nm，高6 nm。染色質(zhì)就是由一連串的核小體所組成。當(dāng)一連串核小體呈螺旋狀排列構(gòu)成纖絲狀時(shí)，DNA的壓縮包裝比約為40。纖絲本身再進(jìn)一步壓縮后，成為常染色質(zhì)的狀態(tài)時(shí)，DNA的壓縮包裝比約為1000。有絲分裂時(shí)染色質(zhì)進(jìn)一步壓縮為染色體，壓縮包裝比高達(dá)10 000，即只有伸展?fàn)顟B(tài)時(shí)長(zhǎng)度的萬(wàn)分之一?！ ?/p>
染色體
染色體是一個(gè)獨(dú)立行動(dòng)的結(jié)構(gòu)單位，在細(xì)胞分裂時(shí)傳遞給子細(xì)胞一份染色體拷貝。因此每條染色體必須能復(fù)制，所復(fù)制的拷貝最后分離并被正確地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。這些基本功能是由真核生物染色體三種特定的DNA序列所控制，即DNA復(fù)制起點(diǎn)、著絲粒和端粒。
從DNA到染色體不論是形態(tài)還是長(zhǎng)度都相差很大。人類最長(zhǎng)的第一個(gè)染色體全長(zhǎng)僅10mm，但其DNA卻長(zhǎng)達(dá)7.2cm；一個(gè)細(xì)胞核直徑僅5nm，在這樣一個(gè)小小的空間中卻要納下全長(zhǎng)近200cm的DNA，人們不禁要問(wèn)DNA如何形成染色體，納入小小的核中。解決這個(gè)問(wèn)題同樣是由很多科學(xué)家差不多經(jīng)過(guò)20年的努力，最終提出了為大多數(shù)能接受的模型?側(cè)環(huán)模型?！ ?/p>
實(shí)驗(yàn)
早在1956年為雙螺旋模型提供X衍射證據(jù)的Wilkins和另一位科學(xué)家Vittorio Luzzati對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行了X衍射研究，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)中具有間隔為100?的重復(fù)性結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)和DNA本身的結(jié)構(gòu)從來(lái)不會(huì)表現(xiàn)出這種重復(fù)性。推測(cè)可能是組蛋白和DNA的結(jié)合方式迫使DNA折疊或纏繞成具有100?周期的重復(fù)結(jié)構(gòu)。
Clark和Felsenfeld于1971年首先用葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease)來(lái)作用染色質(zhì)，發(fā)現(xiàn)有一些區(qū)域?qū)怂崦该舾?，有一些則不敏感，不敏感的區(qū)域比較均一，這暗示染色體中存在著某些亞單位。接著Hewish和Burgoyun（1973年）用內(nèi)源核酸酶消化細(xì)胞核，再?gòu)暮酥蟹蛛x出DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一系列DNA片段，它們相當(dāng)于長(zhǎng)約200bp的一種基本單位的多聚體。表明組蛋白結(jié)合在DNA，以一種有規(guī)律的方式分布，以致產(chǎn)生對(duì)核酸酶敏感的只是某些限定區(qū)域。M.Noll（1974年）用外源核酸酶處理染色質(zhì)，然后進(jìn)行電泳，證實(shí)了以上結(jié)果，他測(cè)得前三個(gè)片段的長(zhǎng)度分別為205，405，605bp長(zhǎng)，每個(gè)片段相差200bp，即染色質(zhì)可能以200bp為一個(gè)單位。這正好和以下電鏡觀察的結(jié)果相映證。
與此同時(shí)Olins夫婦（1974）和Pierre Chambon等（1975）在電鏡下觀察到大鼠胸腺和雞肝染色質(zhì)的“繩珠”狀結(jié)構(gòu)，小球的直徑為100 ?,Olins并把這種小球稱為n小體(n-body即nu body)，有時(shí)譯成鈕體。
X衍射圖表明組蛋白的多聚體都是緊密相聯(lián)，并無(wú)可容納像DNA分子那樣大小的孔洞，所以不可能由DNA之“繩”穿過(guò)組蛋白之“珠”，而只可能是DNA纏繞在“珠”的表面。
電泳的結(jié)果和電鏡觀察到“繩珠”結(jié)構(gòu)之間是什么樣的關(guān)系呢？Kornberg和Thomas 1974年用實(shí)驗(yàn)回答了這一問(wèn)題。他們先用小球菌核酸酶稍稍消化一下染色質(zhì)，切斷一部分200核苷酸對(duì)單位之間的DNA，使其中含有單體、二聚體、三聚體和四聚體等。然后經(jīng)離心將它們分開(kāi)。每一組再通過(guò)凝膠電泳證明其分子大小及純度。然后分別用電鏡來(lái)觀察各組的材料；結(jié)果單體均為一個(gè)? 的小體，二聚體則是兩個(gè)相聯(lián)的小體，同樣三聚體和四聚體分別由三個(gè)小體和四個(gè)小體組成，表明200核苷酸的電泳片段長(zhǎng)度級(jí)差正好是電鏡觀察到的一個(gè)：“繩珠”單位，他們稱其為核小體（nucleosome）或核粒，提出了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的“繩珠”模型?！ ?/p>
原理
人們接著用化學(xué)交聯(lián)、高鹽分離組蛋白，以及X衍射等方法進(jìn)一步研究組蛋白多聚體的結(jié)構(gòu)、排列以及怎樣和DNA結(jié)合的，從而建立了核小體模型。1984年Klug和Butler進(jìn)行了修正。核小體的構(gòu)造可用圖表示：
每一個(gè)核小體結(jié)合的DNA總量為200bp左右，一般在150~250變化范圍（micrococcal nuclease)輕微消解染色質(zhì)而得知的。連接兩個(gè)核小體的連接DNA (linker DNA) 是最容易受到這種酶的作用，因此微球菌核酸酶在連接DNA處被切斷，此時(shí)每個(gè)重復(fù)單位的DNA長(zhǎng)約200bp，而且是和五種組蛋白相結(jié)合，保持著核小體的結(jié)構(gòu)。也就是“繩珠”結(jié)構(gòu)的繩被切斷，剩下一個(gè)一個(gè)的“珠”?！ ?/p>
基本單位
核小體是染色體的基本單位。
抗核小體抗體(AnuA)
核小體是細(xì)胞染色質(zhì)中的一種成分，它是由DNA和組蛋白以特殊的方式相連而組成的。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的誘導(dǎo)和致病中有重要作用。
臨床意義：抗核小體抗體比抗dsDNA抗體、抗組蛋白抗體更早出現(xiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的早期，并且特異性較高。陽(yáng)性率為50-90%，特異性>98%。
每個(gè)核小體單位包括200bp左右的DNA超螺旋和一個(gè)組蛋白八聚體及一個(gè)分子H1；組蛋白八聚體構(gòu)成核小體的盤狀核心結(jié)構(gòu)；146bp的DNA分子超螺旋盤繞組蛋白八聚體1.75圈, 組蛋白H1在核心顆粒外結(jié)合額外20bp DNA，鎖住核小體DNA的進(jìn)出端，起穩(wěn)定核小體的作用。 包括組蛋白H1和166bp DNA的核小體結(jié)構(gòu)又稱染色質(zhì)小體；兩個(gè)相鄰核小體之間以連接DNA相連，典型長(zhǎng)度60bp，不同物種變化值為0～80bp；組蛋白與DNA之間的相互作用主要是結(jié)構(gòu)性的，基本不依賴于核苷酸的特異序列，實(shí)驗(yàn)表明，核小體具有自組裝 (self-assemble) 的性質(zhì)；核小體沿DNA的定位受不同因素的影響，進(jìn)而通過(guò)核小體相位改變影響基因表達(dá)。：
其功能與染色質(zhì)的濃縮有關(guān)，且能夠進(jìn)行自裝配?！ ?/p>
注意事項(xiàng)
AnuA被定義為與組織蛋白暴露在染色質(zhì)的部分發(fā)生反應(yīng)的抗體，在染色質(zhì)內(nèi)找到的DNA結(jié)構(gòu)，或者一個(gè)由天然組織蛋白DNA復(fù)合物構(gòu)成的表位，特別要排除的是抗體與非組織蛋白的反應(yīng)和隱藏在染色質(zhì)內(nèi)的組織蛋白表位的反應(yīng)，以及與DNA結(jié)構(gòu)如A、C以及Z構(gòu)型的反應(yīng)。這些在染色質(zhì)中均不存在，因此，并不是所有組織蛋白和DNA活性的抗體都具有抗染色質(zhì)活性。染色質(zhì)作為ELISA中的抗原最有用的構(gòu)型是脫H1染色質(zhì)和核小體核心粒子。在這兩種情況下，天然染色質(zhì)通過(guò)微球菌核酸酶消化溶解，H1和非組織蛋白被除去，再用0.5M生理鹽水在中性pH條件下而得染色質(zhì)。核小體核心粒子由包裹在天然組織蛋白(H2A、H2B、H3、H4)八聚體DNA組成。多元核小體核心粒子，DNA鏈未被核酸酶切斷時(shí)，叫做H1修飾染色質(zhì)。人們開(kāi)始重新關(guān)注AnuA。AnuA是首批被發(fā)現(xiàn)的自身抗體之一，因?yàn)樗鼈兪墙M成引起紅斑狼瘡的細(xì)胞排列構(gòu)造的大多數(shù)抗體。許多研究資料表明了這種抗體輔助診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡和藥物引起的狼瘡(DIL)的臨床應(yīng)用，并且從某種意義上來(lái)說(shuō)，AnuA的定量曾是在臨床實(shí)驗(yàn)室所進(jìn)行的最普遍的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)之一。AnuA在過(guò)去的10年里曾有過(guò)許多的名字：紅斑狼瘡因子、抗核小體、抗DNP以及抗(H2AH2BDNA)，這些自身抗體可在近乎75%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者身上找到，并且有達(dá)100%的患者是由藥物引起的，它們也可在20%～50%的1型自身免疫型肝炎患者身上找到?！ ?/p>
臨床意義
在80%的MRL/lprDIL小鼠中可產(chǎn)生核小體特異性抗體，該自身抗體產(chǎn)生早，先于其他抗核抗體，與腎小球腎炎有關(guān)。SLE患者多克隆核小體特異性自身抗體的抗原反應(yīng)與鼠類SLE模型表現(xiàn)相似，核小體在SLE中作為主要自身抗原近年已得到證實(shí)。靶器官中免疫復(fù)合物的沉積和炎性介質(zhì)(包括補(bǔ)體)的大量活化是引起SLE全身性組織炎癥損傷的基本機(jī)制之一。核小體會(huì)成為多克隆B細(xì)胞活化劑，這可能與SLE疾病的起始階段有關(guān)；但更重要的是，核小體是SLE中致病性T輔助細(xì)胞識(shí)別的自身抗原，不僅引起同源B細(xì)胞產(chǎn)生核小體特異性自身抗體，而且引起抗DNA抗體和抗組蛋白抗體的形成。AnuA在抗dsDNA陰性的SLE患者中有很高的陽(yáng)性率(可達(dá)60%~65%)［8，16］，因此AnuA對(duì)SLE患者更具有診斷價(jià)值。最近有證據(jù)表明，除了傳統(tǒng)的致病性抗雙鏈DNA抗體及其抗原抗體復(fù)合物外，核小體和組蛋白成分的自身抗體及其抗原抗體復(fù)合物，在SLE的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，尤其是在DIL腎炎致病機(jī)制上意義重大［6］。核小體的組蛋白成分(氨基末端帶強(qiáng)陽(yáng)性電荷)可促進(jìn)免疫復(fù)合物與腎小球基底膜陰離子位點(diǎn)的結(jié)合，包括既作為植入抗原使原位免疫復(fù)合物得以形成，也可使含有核小體特異性抗體的循環(huán)免疫復(fù)合物得以沉積。在以上兩種情況下，均可使腎小球基底膜的通透性增加，且產(chǎn)生炎性免疫應(yīng)答反應(yīng)。鐘清等［7］研究表明，LN組患者AnuA陽(yáng)性率明顯高于無(wú)腎炎組，AnuA對(duì)LN的診斷和監(jiān)測(cè)具有重要意義。此外，蘇茵等［8］也發(fā)現(xiàn)AnuA與患者的皮疹、脫發(fā)、ESR增快、CRP增高、補(bǔ)體降低呈顯著相關(guān)性，其滴度高低也與SLE疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分呈明顯正相關(guān)?！ ?/p>
特性
有兩項(xiàng)關(guān)于AnuA重要評(píng)論表明這種抗體對(duì)SLE和DIL具有敏感性和特異性，并且AnuA的存在通常在SLE與腎小球腎炎患者中相聯(lián)系。AnuA較抗DNA具有更高的敏感性。如果陰陽(yáng)性分割點(diǎn)升高，能使抗核小體對(duì)狼瘡更加敏感。近年來(lái)，由于核小體抗原純化技術(shù)的改進(jìn)，提高了AnuA對(duì)SLE患者的診斷特異性。研究結(jié)果表明，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)AnuA在SLE患者中具有很高的敏感性和特異性。國(guó)外報(bào)道，對(duì)SLE患者進(jìn)行AnuA檢測(cè)，起敏感性和特異性分別為56.0%~64.2%和97.0%~98.8%，國(guó)內(nèi)蘇茵等提出，AnuA可出現(xiàn)于SLE疾病進(jìn)程的各個(gè)時(shí)期，對(duì)SLE的敏感性高(69.9%)、特異性強(qiáng)(97.9%)，可能是SLE的標(biāo)記抗體之一，但許苛等，報(bào)道測(cè)定敏感性偏低(55.8%)、特異性偏低(95.3%)?？紤]與AnuA的來(lái)源不同、檢測(cè)人群和疾病活動(dòng)度不同以及所用實(shí)際不同有關(guān)，但是與dsDNA抗體、抗Sm抗體比較，敏感性均有了較大的提高，且有良好的特異性，可用于SLE的診斷，多種商品化檢測(cè)試劑盒的出現(xiàn)，使該自身抗體應(yīng)用于臨床SLE等結(jié)締組織病的診斷和鑒別診斷成為可能?！ ?/p>
檢測(cè)技術(shù)
許多不同的技術(shù)已被用于檢測(cè)AnuA，除了LE細(xì)胞試驗(yàn)以外，還有染色質(zhì)包被的串珠乳膠凝集試驗(yàn)，以及免疫沉淀(用天然組織蛋白重組酸萃取的組織部分和ELISA法都已被使用。早期的研究用“脫氧核苷蛋白”作抗原研制出一種孵育在1M生理鹽水中的染色質(zhì)中的預(yù)備品，但未得到明確鑒定。后期報(bào)道已有更好的方法來(lái)鑒定該預(yù)備品，并能分析凝膠電泳后的蛋白質(zhì)和DNA的組成。染色質(zhì)的類型分析以及陰、陽(yáng)性判斷對(duì)于輔助診斷SLE患者而獲取高敏感性和特異性是非常重要的。第一種研究用于以變性的H2A和H2B作為抗原進(jìn)行DNA再造，由血清結(jié)合上組織蛋白的變性區(qū)域，即天然染色質(zhì)非暴露部分；第二種研究用于整條染色質(zhì)作為抗原，剩余的Scl70蛋白引起抗Scl70，血清在此情況下產(chǎn)生弱陽(yáng)性；第三種研究用于一個(gè)陰、陽(yáng)性的弱的(低的)判斷(硬皮患者血清呈現(xiàn)弱陽(yáng)性)。
第一代與第二代核小體檢測(cè)技術(shù)的比較通過(guò)對(duì)SLE組(96例)、患者對(duì)照組(73例)、正常對(duì)照組(47例)進(jìn)行AnuA和抗dsDNA抗體的檢測(cè)，采用由德國(guó)EUROIMMUN公司生產(chǎn)的試劑盒和美國(guó)Coda公司生產(chǎn)的全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀檢測(cè)。結(jié)果表明，EUROIMMUN推出的第二代抗核小體抗體ELISA檢測(cè)試劑與第一代比較敏感度差異不大，但特異性卻有了明顯提高。早期因核小體抗原純化制備方法存在技術(shù)上的問(wèn)題，純化的核小體抗原常含有H1、Scl70(DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，一種DNA結(jié)合蛋白)、殘留的染色質(zhì)DNA和其他非組蛋白等蛋白成分，導(dǎo)致多種結(jié)締組織病患者血清與核小體抗原交叉反應(yīng)，尤其是在10%～68%的硬皮病患者中也可檢測(cè)出AnuA，使得該抗體作為SLE特異性抗體的臨床應(yīng)用價(jià)值得到了很大的限制；而第二代AnuAELISA試劑在抗原的制備上有了很大的改進(jìn)，抗原分離純化技術(shù)提高，純化的核小體抗原制品只含核小體單體，不含以上提到的DNA和組蛋白等雜質(zhì)成分，可排除硬皮病患者血清假陽(yáng)性反應(yīng)，這樣就使得AnuA對(duì)SLE的診斷價(jià)值得到了充分的發(fā)揮，極大提高了AnuA對(duì)SLE的特異性，目前已開(kāi)始應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測(cè)?！ ?/p>
研究新進(jìn)展
目前，國(guó)內(nèi)已有少數(shù)醫(yī)院開(kāi)展了AnuA的檢測(cè)，也已發(fā)表了數(shù)篇相關(guān)報(bào)道。有文獻(xiàn)報(bào)道，以核小體多肽特異性抗原治療鼠狼瘡模型的研究發(fā)現(xiàn)，核小體多肽特異性抗原可以抑制TH細(xì)胞和B細(xì)胞的激活，從而為研究SLE的發(fā)病機(jī)制治療帶來(lái)了新的曙光［20］。但需要指出的是：AnuA的檢測(cè)對(duì)SLE的診斷有重要意義，不同的核小體來(lái)源、不同的檢測(cè)人群和疾病活動(dòng)度、以及檢測(cè)試劑、方法等均會(huì)帶來(lái)結(jié)果差異。該抗體與抗Sm抗體不同，并非是SLE標(biāo)記抗體。雖然已發(fā)現(xiàn)AnuA對(duì)診斷SLE的敏感性和特異性比抗dsDNA抗體高，但仍有不完全一致的結(jié)果。我國(guó)的情況如何還應(yīng)進(jìn)行大樣本、多中心檢測(cè)從而得到更合理、更準(zhǔn)確的結(jié)論。SLE的診斷不能僅憑某一種抗體陽(yáng)性與否加以肯定或否定，在建立該抗體檢測(cè)前首先要明確其臨床意義，其次，要避免假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，如同其他自身抗體的檢測(cè)一樣，臨床醫(yī)師在診治工作中必須密切結(jié)合患者的臨床資料，正確看待檢測(cè)結(jié)果，切勿以實(shí)驗(yàn)室檢查代替一切。
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