雙向電泳
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雙向電泳（two-dimensional electrophoresis）
是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進行SDS-PAGE（按照分子大小），經(jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。
蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心. 雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白，并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的，而是隨環(huán)境而變化. 雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離. 目前，隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，已能分離出10 000個斑點(spot). 當(dāng)雙向電泳斑點的全面分析成為現(xiàn)實的時候，蛋白質(zhì)組的分析變得可行.
樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關(guān)2-DE的成效，目標(biāo)是盡可能擴大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化學(xué)法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白，兩者聯(lián)合有協(xié)同作用. 對IEF(isoelectric focusing)樣品的預(yù)處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質(zhì). 理想的狀態(tài)是人們應(yīng)一步完成蛋白的完全處理. 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉(zhuǎn)換. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內(nèi)的二硫鍵，增強了蛋白的溶解度，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)至第二向的增加］. 兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度，作為互補試劑會更有效. 在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內(nèi)切酶去除核酸(DNA). 除此之外，機械力被用來對蛋白分子解聚，如超聲破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的，可在其水化的過程中加樣，覆蓋整個IPG膠，避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失］. 此外，低豐度蛋白(low abundance protein)在細胞內(nèi)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能，代表蛋白質(zhì)組研究的“冰山之尖”，故分離低豐度蛋白是一種挑戰(zhàn). 亞細胞分級和蛋白質(zhì)預(yù)分級、提高加樣量(已達到1～15 mg級的標(biāo)準(zhǔn))、應(yīng)用敏感性檢測，可以提高其敏感性. 如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術(shù)來分析和檢測. 提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點. 由于堿性pH范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)的不穩(wěn)定及逆向電滲流(EOF)的產(chǎn)生，對PI(等電點)超過10的堿性蛋白，通過產(chǎn)生0～10%的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之. 亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質(zhì)的穩(wěn)定性.
2-DE面臨的挑戰(zhàn)是高分辨率和重復(fù)性. 高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重復(fù)性允許進行凝膠間配比(match). 對2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O(shè)’Farrell’s技術(shù)為基礎(chǔ). 第一向應(yīng)用載體兩性電解質(zhì)(carrier ampholyte, CA)，在管膠內(nèi)建立pH梯度. 隨著聚焦時間的延長，pH梯度不穩(wěn)，易產(chǎn)生陰極漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分離堿性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦達到平衡狀態(tài)，堿性蛋白會離開凝膠基質(zhì)而丟失. 因此，在等電區(qū)域的遷移須在平衡狀態(tài)之前完成，但很難控制. 3)IPG-DALT發(fā)展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出現(xiàn)解決了pH梯度不穩(wěn)的問題. IPG通過immobiline共價偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重復(fù)性. 目前可以精確制作線性、漸進性和S型曲線，范圍或?qū)捇蛘膒H梯度. 新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯(lián)合商品化的pH 4～7的梯度可對蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)組重疊群(proteomic contigs)從而有效分離.
分離后的斑點檢測(spot detection)亦很重要. 所采用的檢測策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，還需考慮反應(yīng)的線性、飽和閾/動態(tài)范圍、敏感性、對細胞蛋白群的全體定量分析的適應(yīng)性、可行性. 目前，沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術(shù). 銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法，可檢測少到2～5ng的蛋白，因此較考馬斯亮藍R-250敏感. 多數(shù)糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色，一些有機染料不適于PVDF膜. 放射性標(biāo)記不依賴其代謝的活性，并僅適于對合成的蛋白質(zhì)檢測. 另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳)，即應(yīng)用兩種不同的染料熒光標(biāo)記兩個樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個，避免了幾種2-DE的比較，可在納克級進行檢測.
較早期相比，2-DE有兩個主要的進步：首先，極高的重復(fù)性使有機體的參考圖譜，可通過Internet獲得，來比較不同組織類型、不同狀態(tài)的基因表達；其次，高加樣量使得2-DE成為一項真正的制備型技術(shù).
常見問題及其解答重泡脹后的膠可以不用轉(zhuǎn)移到另一個電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？ 一般情況下是可以的。但當(dāng)上樣量特別大時，可能會有一部分蛋白質(zhì)沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉(zhuǎn)移到另外一個電泳漕中進行電泳。 為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后會減少，暴露出了膠條的背面？ 這是因為 BioRad 的電泳槽有個蓋子。為了固定電泳槽中的膠條，這個蓋子上設(shè)計了對應(yīng)的突起，以便壓住膠條。由于虹吸作用，這個突起會導(dǎo)引礦物油到相鄰的空電泳槽，從而降低有膠條的電泳槽中的礦物油液面。如果由此把膠條暴露在空氣中，那對等電聚焦的影響將是毀滅性的。為了防止這個現(xiàn)象的發(fā)生，可以在相鄰的空電泳槽里，也加入適量（ 80 ％滿）的礦物油。 跑第一向時，為什么要設(shè)定一個電流的最大值電壓(50 μ A/ 膠)？ 電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會導(dǎo)致膠條的溫度增加。當(dāng)溫度超過 30 攝氏度時，緩沖液里的尿素就容易解離，產(chǎn)生一些極性分子，從而對等電聚焦產(chǎn)生影響。 跑第一向時，為什么剛開始的電壓比較低，而后逐漸增高？ 剛開始時，體系內(nèi)的帶電小分子比較多（比如無機鹽和雙極性分子）。所以在這個階段，電流主要是由這些小分子的移動所產(chǎn)生的。由于這些分子質(zhì)量小，移動他們不需要很高的電壓。當(dāng)這些小分子移動到他們的目的地時（無機鹽移動到極性相反的電極；兩性分子移動到對應(yīng)的 pH 條帶），體系內(nèi)的蛋白質(zhì)才開始肩負(fù)起運載電流的任務(wù)，逐漸向所對應(yīng)的 pH 區(qū)域移動。 跑第一向時，為什么會產(chǎn)生一條藍色的條帶，并逐漸向酸性端移動？ 藍色條帶是緩沖液中痕量的溴酚藍被聚焦所產(chǎn)生的。溴酚藍也是 pH 指示劑，當(dāng)它移動到酸性區(qū)時（ pH4 ），顏色會變成黃色。溴酚藍的這個移動過程大體上發(fā)生在極性小分子的聚焦之后，蛋白質(zhì)大分子聚焦之前。 跑第一向時，為什么電壓總達不到預(yù)定值？ 當(dāng)上樣量比較大時或體系內(nèi)鹽分比較多時，聚焦的電壓有可能達不到所設(shè)定的數(shù)值。 跑第一向時，在電壓達到預(yù)定值后，電流為什么會降低？ 當(dāng)上樣量比較少時，所有蛋白在較短的時間內(nèi)就移動到所對應(yīng)的 pH 值區(qū)域值，從而變成中性分子。這樣，體系的電阻越來越大，在恒定的電壓下，電流就會越來越小。 跑第一向時，為什么在兩個電極絲附近有氣泡產(chǎn)生？ 等電聚焦完成后，所有的蛋白質(zhì)都移動到了相應(yīng)的 pI 值區(qū)域，而成為中心分子。這是加在體系上的電壓就開始電解水分子，在陽極產(chǎn)生氧氣，在陰極產(chǎn)生氫氣。 重泡脹緩沖液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，雙極性分子的作用是什么？ 硫脲的作用是增加蛋白質(zhì)的溶解性，特別是堿性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質(zhì)的溶解性。當(dāng)?shù)鞍滓苿拥较鄳?yīng)的 pH 值后，就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質(zhì)分子容易聚集，從而降低其在隨后的二向膠時的遷移效率，可能會造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會鑒定中性蛋白質(zhì)之間的相互作用，防止它們的聚集。 怎樣估計 2D 膠上蛋白質(zhì)點的分子量和 pI 值？ 可以用 BioRad 生產(chǎn)的 2D 膠標(biāo)準(zhǔn)蛋白來校準(zhǔn)。也可以用體系內(nèi)已知蛋白來做比對。 為什么 2D 膠上的蛋白點有橫的和豎的脫尾？ 橫的脫尾可能是： 1 ）一向等電聚焦不完全； 2 ）某些蛋白質(zhì)本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的豐度太高。豎的脫尾是因為跑二向時，蛋白的溶解度不好。 什么成分會影響 2D 膠的效果？ 核酸，鹽，去垢劑等等。 2D 膠的上樣量應(yīng)該在什么范圍？ 上樣量和樣品有關(guān)。樣品內(nèi)蛋白種類多的上樣量要大些，這樣每個點才有足夠的量被檢測到。一般的全細胞裂解體系，上樣量大概在 100 微克（銀染）到 500 微克（考染）之間。 我的蛋白質(zhì)濃度很低，應(yīng)該用什么方法來濃縮？ 蛋白質(zhì)的濃縮有很多方法。大致有超濾法，沉淀法和透析法。超濾比較溫和，對蛋白質(zhì)不會有修飾和改變，蛋白的種類一般不會有丟失。它的缺點是總樣品的量可能會減少（被膜所吸附）。另外超濾對樣品的要求比較高。甘油，去垢劑都會堵塞濾膜，影響超濾的效果。沉淀法比較快速，容易操作，對鹽，甘油，去垢劑的耐受性好。缺點是可能會有部分種類的蛋白沒有被沉淀下來（丟失）。沉淀法中，又以 TCA 法最為普遍使用。使用 TCA 法時，一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉淀兩次，去處殘留的 TCA 和其他沉淀下來的雜質(zhì)。透析法只使用于量比較大的樣品，量小時，操作困難。 透析法可以和超濾法聯(lián)用。先把樣品透析到一個比較干凈的環(huán)境（ 不含鹽，甘油，去垢劑或其它雜質(zhì)，比如碳酸氫氨溶液），然后再進行超濾。
附：雙向電泳完整的操作步驟
（一）第一向等電聚焦
1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。
3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，充分混勻。
4. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cm pH 4-7），室溫中放置10分鐘。
5. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。
6. 當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護層。
7. 分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+）對應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。
8. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
9. 對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。
10.聚焦結(jié)束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。
（二）第二向SDS-PAGE電泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水（沒有milliq的話ddh2o也行，注，水云深浪按）、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。
2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。
3. 從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。
4. 配制膠條平衡緩沖液I。
5．在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時出現(xiàn)的縱條紋。
6. 將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
7. 配制膠條平衡緩沖液II。
8. 第一次衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
9. 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。
10.將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。
11.將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。
12.第二次衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。
13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。
14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。
15.用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時，要注意是推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。
16.放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。
17.在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。
18.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。
19.電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。
20.進行染色。
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