蛋白質(zhì)測(cè)序
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概念
當(dāng)前，所謂蛋白質(zhì)測(cè)序，主要指的是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Primary structure)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目。很多場(chǎng)合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。
蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬(wàn)個(gè)不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)?！ ?/p>
測(cè)序要求
●1 樣品必需純（>97%以上）；
●2 知道蛋白質(zhì)的分子量；
●3 知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成；
●4 測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。
●5 測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量?！ ?/p>
蛋白質(zhì)和多肽氨基酸順序的測(cè)定
●1肽鏈的拆開(kāi)和分離
●2測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目
●3二硫鍵的斷裂
●4測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比
●5N端、C端的測(cè)定
●6多肽鏈斷裂
●7測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。
●8確定肽段在多肽鏈中的次序。
●9確定原多肽鏈中二硫鍵的位置?！ ?/p>
酸水解
●常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進(jìn)行水解，反應(yīng)時(shí)間約20小時(shí)。
●此法的優(yōu)點(diǎn)是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點(diǎn)是色氨酸被沸酸完全破壞；
●含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門(mén)冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基?！ ?/p>
堿水解
●一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時(shí)。
●由于水解過(guò)程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。
●該法的優(yōu)點(diǎn)是色氨酸在水解中不受破壞?！ ?/p>
酶水解
●目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或稱(chēng)蛋白酶（proteinase）已有十多種。
●應(yīng)用酶水解多肽不會(huì)破壞氨基酸，也不會(huì)發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)物為較小的肽段?！ ?/p>
測(cè)定步驟
1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱(chēng)為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈(亞基).
2 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。
3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。
二硫鍵的切割與保護(hù)（元素后數(shù)字為下標(biāo)）
a 過(guò)甲酸〔performic acid〕 不可逆
－CH2SO3H
b、還原＋氧化 不可逆
［ 巰基乙醇，DTT ］ ＋ 碘乙酸等
－S-CH2-COOH
c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
－R1-S-S-R2 ＋ HSO3-
R1-S- + R2-S-SOH3
可以通過(guò)加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。
巰基（-SH）的保護(hù)
作用：這些反應(yīng)(見(jiàn)右圖）可用于巰基的保護(hù)。
4 測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比（如右圖）
5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端
多肽鏈端基氨基酸分為兩類(lèi)：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。
6 多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段?？刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開(kāi)來(lái)。
7 測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序
8 確定肽段在多肽鏈中的次序。
利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。
9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置
一般采用胃蛋白酶處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。
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