基因診斷與性病/核酸分子雜交方法

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基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病
- 核酸分子雜交法
  - 核酸探針的種類
  - 核酸探針的標(biāo)記和檢測
  - 核酸分子雜交方法

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，新的核酸分子雜交技術(shù)不斷出現(xiàn)和完善，核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。

在固相雜交中，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，所以比較常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。

液相雜交是一種研究最早且操作簡便的雜交類型，由于液相雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高，所以不如固相雜交那樣普遍。近幾年由于雜交檢測技術(shù)的不斷改進(jìn)，商業(yè)性基因探針診斷盒的實(shí)際應(yīng)用，推動(dòng)了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展，下面對固相雜交和液相雜交分別進(jìn)行介紹。

（一）固相膜核酸分子雜交方法。

固相核酸雜交多是在膜上進(jìn)行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法。

1．DNA的變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵,Southern印跡雜交時(shí)DNA在凝膠中變性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時(shí)，然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時(shí)。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強(qiáng)酸會(huì)使核酸降解。堿變性可避免DNA的降解、熱變性要在低DNA濃度（100μg/ml）和低鹽濃度（0.1SSC 15mmol/L NaOH，1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)下進(jìn)行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml，加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10mol/l HC1或5mol/L NaH2PO4調(diào)pH到7-8(亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100℃后，調(diào)至中性，或只加熱100℃10min)。DNA變性可用OD260增加（約30-40%）來檢測，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰溶保存。

2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min～2h，涼干，DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后再在80℃真空干燥2h。

3．預(yù)雜交。濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，用封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴中保溫3-12h，當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68℃時(shí)，在濾膜表面常會(huì)形成水氣泡，輕輕晃動(dòng)袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點(diǎn)對于保證濾膜表面充分浸潤預(yù)雜交液很重要。

4．雜交?！乃≈腥〕鏊芰洗眉舻都糸_一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液，用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好足量的液體保持濾膜濕潤（50ul/cm2）。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/L　EDTA，變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口。雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行，所需時(shí)間視探針和檢測靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般為4-20h。

5．洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中,室溫下漂洗5min,再將濾膜移入2×SSC和0.1% SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動(dòng)),然后將濾膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃輕輕搖動(dòng)保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。

洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12℃以下，［Tm=69.3+0.41×(G+C）%］，雙鏈DNA的Tm值隨錯(cuò)配堿基對數(shù)每增加1%而遞減1℃。

6．結(jié)果顯示。放射性測定方法，固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射自顯影法、另一是液閃計(jì)數(shù)法，放射自顯影法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再顯影，定影即可。對于雜交信號較強(qiáng)的固相膜，用一塊增敏屏可顯著增強(qiáng)暴光強(qiáng)度。此外，為了減弱32P的放射，暴光通常在-20℃或-80℃下進(jìn)行。液閃計(jì)數(shù)法主要用于斑點(diǎn)和狹縫雜交及為了比較兩個(gè)雜交信號的強(qiáng)弱等情形，方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊（每份樣品1塊），80℃真空干燥后裝閃爍瓶，加入2-5ml閃爍液，剪2-3塊無樣品作為本底對照，在液體閃爍計(jì)數(shù)器上自動(dòng)計(jì)數(shù)，液體計(jì)數(shù)測定放射性強(qiáng)度也可以在放射自顯影之后進(jìn)行。

（二）固相核酸分子雜交類型

1．菌落原位雜交（colony in　situhybridization）。是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號、并與主平板上的菌落對位。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。

②培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。

③在一塊皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。

④5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl）浸濕的濾紙上，放置10min。

⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L Tris-HClpH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min，重復(fù)中和一次。

⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min，SSPE配成20×貯備液：3.6mol/lNaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。

⑦將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。

2．斑點(diǎn)雜交（Dot blot）。是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。

（1）DNA斑點(diǎn)雜交：

①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。

③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上,每個(gè)樣品一般點(diǎn)μl(2~10μg DNA)。

④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）RNA斑點(diǎn)雜交：與上法類似，每個(gè)樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8μl點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。

（3）完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：應(yīng)用類似檢測細(xì)菌菌落的方法，可以對細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測，將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗辜?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。

3.Southern印跡雜交（Southern blot）。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交的基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和和高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上、烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著，附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確立探針互補(bǔ)的每一條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多消化產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

（1）瓊脂糖凝膠電泳。利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消解片段（0.3～25kb）分離開，分離大分子DNA片段（800-12000bp）用低濃度瓊脂糖（0.7%），分離小分子片段（500～1000bp）用高濃度瓊脂糖（1.0%），300-5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠。根據(jù)分離樣品品質(zhì)，分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽。

電泳時(shí)，同時(shí)將分子量標(biāo)記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過夜，電泳完畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在灌膠前加入膠片中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5，曝光20-40s。

（2）硝酸纖維素膜吸印。

［1］將膠片切成合適大小，切去右上角作為記號。

［2］將膠片放進(jìn)盛有變性緩沖液（1.5mol/l NaCl,0.5mol/L NaOH）的盤中輕晃15min。

［3］換到中和緩沖液（1mol/l Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盤中輕晃30min。

［4］裁一張硝酸纖維素膜、2-4張3mm濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙），都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路）。先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC緩沖液,接觸膠和硝酸纖維素膜時(shí)都要戴手套操作。

［5］平盤上放一塊比膠大的平板上面鋪一張3mm濾紙,起燈蕊作用,盤中加入少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚），不能沒過平板，使3mm濾紙充分飽和。

［6］將膠倒扣在3mm濾紙上。

［7］浸濕的硝酸纖維素膜在膠上，對齊。鋪膜時(shí)從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時(shí)，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。

［8］膜上放一張3mm濾紙，不能與膠接觸。

［9］上面加吸印紙及重物（500g左右）。

［10］通過濾紙的燈芯作用，平盤中的緩沖液就會(huì)通過膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時(shí)更換浸濕的吸印紙，在室溫下轉(zhuǎn)印過夜。

［11］清除上面的東西。用鑷子將膜取出，在6×SSC中洗一下。

［12］自然干燥，80℃烤2h。

［13］這是的膜就可進(jìn)行雜交，或室溫密封保存。

4．Northern印跡雜交（Northernblot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blot。Northern　印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進(jìn)樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)樗鼤?huì)水解RNA的2'-羥基基團(tuán)。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后用低鹽緩沖液洗脫，否則RNA會(huì)被洗脫。在膠中不能加EB，因?yàn)樗鼤?huì)影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照像，樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印。標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機(jī)拍照時(shí)，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會(huì)使RNA信號降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時(shí)，甲基氫氧化銀是一種強(qiáng)力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。

RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法。

<1>試劑：

10×MSE緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/L　EDTA　pH8.0。

5×載樣緩沖液：50%甘油，1mmol/lEDTA，0.4%溴酚藍(lán)。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。

20×SSC；

去離子甲酰胺；

50mmol/LNaOH(含10mmol/L NaCl)；

0.1mol/LTris，pH7.5。

<2>步驟：

［1］40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩沖液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。

［2］等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。

［3］使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE緩沖液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲酰胺10ml。

［4］55℃加熱15min，冰浴冷卻。

［5］加2ml5×載樣緩沖液。

［6］上樣、同時(shí)加RNA標(biāo)記物。

［7］60伏電泳過夜。

［8］取出凝膠，水中浸泡2次，每次min。

［9］室溫下將膠浸到50mmol/l NaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。

［10］室溫下將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。

［11］20×SSC洗膠1h。

［12］20×SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。

［13］取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。

5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）。組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交，而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置，對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動(dòng)向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。

用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針操作的長度以100-400nt為宜，過長則雜交率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16-30nt）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長探針，因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。

探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最為常用，3H標(biāo)記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位，缺點(diǎn)是能量低，35S標(biāo)記探針活性較高，影像分辨率也較好，而32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點(diǎn)。

原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素。標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要，去除蛋白質(zhì)的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水。原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性、穩(wěn)定性上還需進(jìn)一步完善和提高。

6，固相夾心雜交。Dunn等最早介紹了夾心雜交類型，Ranki等又作了進(jìn)一步的改進(jìn)，夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)：（1）樣品不需固定，對粗制樣品能做出可靠的檢測；（2）用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強(qiáng)，因?yàn)橹挥袃蓚€(gè)雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測的信號。

固相夾心法雜交需要兩個(gè)靠近而又互相重疊的探針，一個(gè)做固相吸附探針，另一個(gè)作標(biāo)記檢測探針，樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個(gè)探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)，需要注意的是兩探針必須分別亞克隆進(jìn)入兩個(gè)分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號。

夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)和更容易對小量樣品進(jìn)行操作。Dahlen等利用微孔板進(jìn)行夾心雜交，可同時(shí)進(jìn)行大量樣品檢測，他們先吸附DNA探針加到凹板中，然后用紫外線照射使其固定到塑料板上，用微孔板進(jìn)行夾心雜交還可直接用于PCR技術(shù)。應(yīng)用光敏生物素標(biāo)記探針，檢測PCR產(chǎn)物的敏感性和用32P標(biāo)記探針（3×108cpm/μg）作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點(diǎn)還有可同時(shí)操作多份樣品，加樣、漂洗和讀結(jié)果等步驟可以自動(dòng)化。

7．其它雜交類型

（1）固化探針雜交。該法較少使用，原理是使未標(biāo)記固化探針通過雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標(biāo)抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合，將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗、加入底物顯色并進(jìn)行測定，探針濃度為2μg/ml,80℃雜交，可在10-15min完成，檢測的敏感性為5×106靶序列。

（2）反向雜交：這個(gè)雜交類型是用標(biāo)記的樣品核酸與未標(biāo)記的固化探針DNA雜交，故稱為“反向雜交”。這種雜交方法的優(yōu)點(diǎn)是在一次雜交中，可同時(shí)檢測樣品中幾種核酸。這種雜交方式主要用于進(jìn)行中的核轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)和多種病原微生物的檢測，前者是在轉(zhuǎn)錄過程中標(biāo)記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標(biāo)記樣品核酸。

8．固相膜核酸雜交膜的選用。雜交膜是一種多孔、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面，就可用雜交法進(jìn)行檢測。最常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射性標(biāo)記探針都很方便，產(chǎn)生的本底淺，與核酸結(jié)合的化學(xué)性不是很清楚，推測為非共價(jià)鍵結(jié)合，經(jīng)80℃烤干2h和雜交處理后，核酸仍不會(huì)脫落。硝酸纖維素膜的另一特點(diǎn)是只與蛋白有微弱非特異結(jié)合，這在使用同位素探針中尤為有用。硝酸纖維素膜的缺點(diǎn)是結(jié)合核酸能力的大小取決于轉(zhuǎn)印條件和高濃度鹽（>10×SSC）,與小片核酸(<200bp)結(jié)合不牢，質(zhì)地脆，不易操作。

尼龍膜在某些方面比硝酸纖維素膜好，它的強(qiáng)度大，耐用，可與小至10bp的片段共價(jià)結(jié)合，在低離子濃度緩沖液等多種條件下，它們都可與DNA單鏈或RNA緊密結(jié)合，且多數(shù)膜不需烘烤。尼龍膜韌性好，可反復(fù)處理與雜交，而不丟失被檢標(biāo)本，它通過疏水鍵和離子鍵與核酸結(jié)合，結(jié)合力為350-500μg/cm2，比硝酸纖維素膜（80-100μg/cm2）強(qiáng)許多。尼龍膜的缺點(diǎn)是對蛋白有高親合力，不宜使用非同位素探針。

9．“噪音”的排除?！霸胍簟保╪oise）是固相膜雜交方法常遇到的問題，指標(biāo)記DNA結(jié)合到空白膜上的放射性計(jì)數(shù)，即本底。這個(gè)問題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴(yán)格的雜交條件，二是選擇合格的雜交反應(yīng)液和對膜進(jìn)行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著離子強(qiáng)度的增加，空白膜（未固定DNA對照膜）上的“噪音”水平增加，而在50%甲酰胺-6×SSC的雜交反應(yīng)液中“噪音”最低。目前，最常使用的消除噪音的方法是用Denhardt液與固定膜預(yù)保溫，這樣可以充分封閉膜上的多條非特異結(jié)合位點(diǎn)。

（三）液相核酸分子雜交類型

1、吸附雜交

（1）HAP吸附雜交，羥基磷灰石層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法，在液相中雜交后，DNA：DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上，通過離心使吸附有核酸雙鏈HAP沉淀，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP，然后將HAP置于計(jì)數(shù)器上進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。

（2）親和吸附雜交：生物素標(biāo)記DNA探針與溶液中過量的靶RNA雜交，雜交物吸附到?；?/a>親和素包被的固相支持物（如小球）上，用特異性抗DNA：RNA雜交物的酶標(biāo)單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應(yīng)，加入酶顯色底物。這個(gè)系統(tǒng)可快速（2h）檢測RNA。

（3）磁珠吸附雜交：Gen-Probe公司最近應(yīng)用丫啶翁酯（Acridinium ester）標(biāo)記DNA探針、這種試劑可用更敏感的化學(xué)方法來檢測，探針和靶雜交后，雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠（陽離子磁化微球體）上，溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出，經(jīng)過簡單的漂洗步驟，吸附探針的小珠可用化學(xué)發(fā)光測定。

2、發(fā)光液相雜交

（1）能量的傳遞法。Heller等設(shè)計(jì)用兩個(gè)緊接的探針，一個(gè)探針的一端用化學(xué)發(fā)光基團(tuán)（供體）標(biāo)記，另一個(gè)探針的一端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，并且這兩個(gè)探針靠得很近，兩個(gè)靠得很近的探針用不同的物質(zhì)標(biāo)記（光發(fā)射標(biāo)記）。當(dāng)探針與特異的靶雜交后，這些標(biāo)記物靠得很近，一種標(biāo)記物發(fā)射的光被另一種標(biāo)記物吸收，并重新發(fā)出不同波長的光，調(diào)節(jié)檢測器使自動(dòng)記錄第二次發(fā)射光的波長，只有在兩個(gè)探針分子靠得很近時(shí)，才能產(chǎn)生激發(fā)光，因此這種方法具有較好的特異性。

（2）丫啶翁酯標(biāo)記法。丫啶翁酯標(biāo)記探針與靶核酸雜交后，未雜交的標(biāo)記探針分子上的丫啶翁酯可以用專門的方法選擇性除去，所以雜交探針的化學(xué)發(fā)光是與靶核酸的量成比例的。該法的缺點(diǎn)是檢測的敏感度低（1ng的靶核酸），僅適用于檢測擴(kuò)增的靶序列，如rRNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、液相夾心雜交

（1）親和雜交在靶核酸存在下，兩個(gè)探針與靶雜交，形成夾心結(jié)構(gòu)。雜交完成后，雜交物可移到新的管或凹孔中，在其中雜交物上的吸附探針可結(jié)合到固相支持物上，而雜交物上的檢測探針可產(chǎn)生檢測信號。用生物素標(biāo)記吸附探針，及125I標(biāo)記檢測探針。這個(gè)系統(tǒng)的敏感性可檢測出4×105靶分子，該試驗(yàn)保持了固相夾心雜交的高度特異性。

（2）采用多組合探針和化學(xué)發(fā)光檢測第一類探針是未標(biāo)記的檢測探針和液相吸附探針，它們有50個(gè)堿基長，其中含有30個(gè)細(xì)菌特異序列堿基和20個(gè)堿基的單鏈長尾；第二類探針是固相吸附探針，它可吸附在小珠或微孔板上。未標(biāo)記檢測探針的單鏈長尾用于結(jié)合擴(kuò)增多體（標(biāo)記探針），液相吸附探針和靶雜交物從溶液中分離并固定在小珠或微板上。典型的試驗(yàn)可有25個(gè)不同的檢測探針和10個(gè)不同的吸附探針，第一個(gè)標(biāo)記檢測探針上附著很多酶（堿性磷酸酶或過氧化物酶），可實(shí)現(xiàn)未標(biāo)記檢測探針的擴(kuò)增，使用化學(xué)發(fā)光酶的底物比用顯色反應(yīng)酶的底物敏感。這個(gè)雜交方法用于乙肝病毒、沙眼衣原體、淋球菌以及質(zhì)粒抗性的檢測，敏感性能達(dá)到檢測5×104雙鏈DNA分子。

4、復(fù)性速率液相分子雜交

這個(gè)方法的原理是細(xì)菌等原生物的基因組DNA通常不包含重復(fù)順序，它們在液相中復(fù)性（雜交）時(shí)，同源DNA比異源DNA的復(fù)性速度要快，同源程度越多，復(fù)性速率和雜交率越快。利用這個(gè)特點(diǎn)，可以通過分光光度計(jì)直接測量變性DNA在一定條件下的復(fù)性速率，進(jìn)而用理論推導(dǎo)的數(shù)學(xué)公式來計(jì)算DNA-DNA之間的雜交（結(jié)合）度。