臨床生物化學/探針制備

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臨床生物化學

診斷分子生物學基本技術(shù)
- 分子生物學實驗基礎(chǔ)
  - 基因工程的常用工具
  - 目的基因
  - 基因庫的建立
  - 核酸的分離與純化
  - 探針制備

探針制備就是目的基因的標記，核酸標記方法常用的有缺口平移法、隨機引物法、末端標記法等。標記物質(zhì)有放射性元素（如³²P等）和非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。³²P是最常用的核苷酸標記同位素，被標記的dNTP本身就帶有磷酸基團，便于標記，特點是比活性高，可達9000Ci/mmol；發(fā)射的β射線能量高，可達1.70MeV，用它標記的探針自顯影時間短，靈敏度高。³²P的半壽期為14天，應(yīng)隨標隨用，一般標記后，在一周內(nèi)使用，它雖帶來不便，但給使用后廢棄物處理減輕了壓力。使用³²P標記物應(yīng)注意防護，操作時應(yīng)有1-1.5cm厚聚甲基丙烯酸甲酯有機玻璃隔離保護，避免直接照射。操作人員胸前應(yīng)佩帶個人計量器，定期檢測。結(jié)束實驗后，應(yīng)用專用探測器（蓋革-米勒檢測器），檢查工作區(qū)域、手、衣服等，以免污染發(fā)生。其它同位素標記物，同樣應(yīng)注意放射線防護。

非放射性標記有酶標和化學物標記法。酶標方法與免疫測定ELISA方法相似，只是被標記的核酸代替了被標記的抗體，事實上被標記的抗體也稱為探針，閱讀文獻時應(yīng)加以注意?，F(xiàn)有許多商品是生物素（biotin）、地高辛標記的，如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。血凝素（avidin）與生物素有非常高的親和性，當血凝素標記上過氧化物酶或堿性磷酸酶（血凝素-酶），經(jīng)雜交反應(yīng)最終形成：探針-生物素-血凝素-酶復合物（ABC法）。酶催化底物顯色，觀察結(jié)果。與一般的酶反應(yīng)底物不同，ABC法底物顯色后為不溶物，以便觀測結(jié)果。酶標記法復雜、重復性差、成本高，但便于運輸保存，靈敏度與放射物標記相當。化學物標記有的也是利用相應(yīng)酶標抗體形成特異復合物，與上述方法相當，有的則可自發(fā)光。化學標記法簡單、成本低，但靈敏度相對較低。（表18-1）

表18-1　探針標記及特性

標記物	檢測方法	特點
³²P	β射線，自顯影	靈敏度最高，半壽期14天，放射強度1.7MeV
³⁵S	β射線，自顯影	靈敏度高，分辨率好，半壽期87天，0.17MeV
³H	β射線，自顯影	低敏度高，分辨率高，半壽期12年，0.01MeV
¹²⁵I	γ射線，自顯影	靈敏度高，分辨率高，半壽期60天，0.04MeV
生物素	酶標血凝素，顯色	靈敏度好，避免有內(nèi)源性生物素標本
地高辛	酶標地高辛配體，顯色	靈敏度好，分辨率一般
T-T二聚體	酶標抗二聚體抗體，顯色	靈敏度好，紫外照射形成二聚體而標記
BrdU	酶標抗BrdU抗體，顯色	靈敏度好，細菌內(nèi)含質(zhì)粒復制摻入
銪-補骨脂素	熒光	靈敏度一般

缺口平移標記法先由DNase Ⅰ在DNA雙鏈上切出隨機切口，DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5′端核苷酸和3′端修復加入被標記核苷酸同時進行，切口平行推移，可均一標記DNA鏈。（圖18-4、5）

缺口平移法快速、簡便、成本相對較低、比活性較高、標記均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修復DNA的功能，用于大分子DNA標記（＞1000bp最好），單鏈DNA、RNA不能用該法標記。隨機引物法具有上述優(yōu)點，可代替缺口平移法。此外大小、單雙DNA均可標記，標記均勻，標記率高，但不能標記環(huán)狀DNA。利用末端轉(zhuǎn)移酶可進行“尾標”，尾標適用于寡核苷酸探針標記，用于大分子核酸標記因尾巴短而標記比活性降低。尾標不能用dTTP標記，因mRNA的多聚（A）尾而影響雜交特異性。寡核苷酸探針多用于核酸“點”突變檢測，該探針可用核酸合成儀人工合成?？寺√结樢话爿^長，特異性

DNA隨機引物標記法

圖18-5　DNA隨機引物標記法

好，標記量大，雜交檢出信號強。合成探針長度短，一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。合成探針設(shè)計還應(yīng)注意堿基組成G≡C含40％-60％，一種堿基連續(xù)重復不超過4個，以免非特異性雜交產(chǎn)生。還要注意探針自身序列內(nèi)應(yīng)無互補區(qū)域以免產(chǎn)生“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，影響雜交。一個好的探針最終在實踐中才能加以確認。另外，還有利用M13噬菌體載體可復制單鏈DNA的特點，復制合成DNA探針，利用轉(zhuǎn)錄載體（DNA），轉(zhuǎn)錄合成RNA探針。下面就GIBCoBRL公司（Bethesda Research Laboratories美國）的缺口平移法標記生物素試劑盒（bionick labeling system）為例介紹如下：

試劑：	10x dNTP Mix.250μl	10x Enzyme Mix 250μl
	0.2mmol/L each dCTP，dCTP，dTTP	0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ
	0.1mmol/L dATP	0.0075 units/μl DNase Ⅰ
	0.1mmol/L biotin-14-dATP	50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)
	500mmol/L Tris-HCl(pH7.8)	5mmol/L magnesium acetate
	50mmol/L MgCl₂	1mmol/L β-mercaptoethanol
	100mmol/L β-mercaptoethanol	0.1mmol/L phenylmethyl-
		sulfonyl fluoride

	100μg/ml nuclease-free BSA	50％（v/v）glycerol
		100μg/ml nuclease-free BSA
	Control DNA：5μg pBR322 in TE
	stop buffer 300 mM EDTA
	autoclaved H₂O

操作步驟：

將5μl 10x dNTP Mix.；－μl DNA（相當1μg需標記的DNA量）；－μl滅菌蒸餾水加至45μl；再加5μl10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml離心管后。15000xg離心15秒鐘。16℃保溫1小時。加5μl Stop Buffer終止反應(yīng)。乙醇沉淀，備用。