血涂片
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血涂片的顯微鏡檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法,應(yīng)用極廣.特別是對各種血液病的診斷有很大價值.但血片制備和染色不良,常使細(xì)胞鑒別發(fā)生困難,甚至導(dǎo)致錯誤結(jié)論.例如,血膜過厚細(xì)胞重疊縮小,血膜太薄白細(xì)胞多集中于邊緣;染色良好的血片是血液學(xué)檢查主要基本技術(shù)之一?！ ?/p>
目錄 |
血涂片-方法
血涂片
瑞氏染色法原理
1. 瑞氏染料是由酸性染料伊紅和堿性染料美藍(lán)組成的復(fù)合染料。
美藍(lán)(又名亞甲藍(lán)mehyleneblue)為四甲基硫堇染料,有對醌型和鄰醌型兩種結(jié)構(gòu),通常為氯鹽,即氯化美藍(lán)，美藍(lán)容易氧化為一,二,三甲基硫堇等次級染料(即天青)市售美藍(lán)中部份已被氧化為天青.伊紅(又名曙紅cosin)通常為鈉鹽即伊紅化鈉。美藍(lán)和伊紅水溶液混合后產(chǎn)生一種憎液性膠體伊紅化美藍(lán)中性沉淀,即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后,又重新解離為帶正電的美藍(lán)和帶負(fù)電的伊紅離子。
2.細(xì)胞的染色即有物理的吸附作用又有化學(xué)的親和作用.各種細(xì)胞和細(xì)胞的各種成份化學(xué)性質(zhì)不同對各種染色料的親和力也不一樣.因此用染色液染色后在同一血片上可以看到各種不同的色彩,例如血紅蛋白嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)與酸性染料伊紅結(jié)合染粉紅色稱為酸性物質(zhì),細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞漿為酸性,與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合,染藍(lán)色或紫色稱為嗜堿性物質(zhì),中性顆粒成等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合,染紫紅色稱中性物質(zhì).
血涂片-實驗材料、試劑
3.1實驗材料：醫(yī)用采血針、酒精棉球、載玻片、血推片、消毒牙簽
3.2實驗試劑：瑞氏染液、抗B血清、抗A血清、生理鹽水、蒸餾水
3.3儀器設(shè)備：Motic光學(xué)顯微鏡
血涂片-實驗步驟
4.1ABO血型鑒定
4.1.1取一塊清潔玻片，用記號筆標(biāo)上記號。
4.1.2用小滴管吸A型標(biāo)準(zhǔn)血清（抗B）一滴加入左側(cè)，用另一小滴管吸B型標(biāo)準(zhǔn)血清（抗A）一滴加入右側(cè)
4.1.3以穿刺法自左手無名指指尖取血，在玻片的每側(cè)各放入一小滴血，用牙簽攪拌，使每側(cè)抗血清和血液混和。每邊用一支牙簽，切勿混用。
4.1.4靜置室溫下10-15min后，觀察有無凝集現(xiàn)象，并據(jù)此判斷血型。
4.2血涂片的制作及血細(xì)胞觀察
4.2.1取末捎血一滴置于玻片的一端,左手持載玻片,右手以邊緣平滑的推片的一端從血滴前方后移接觸血滴，血滴即沿推片散開。然后便推片與載片夾角保持30-45度穩(wěn)地向前移動,載片上保留下一薄層血膜
4.2.2血涂片制成后可手持玻片在空氣中揮動,使血膜迅速干燥,以免血細(xì)胞皺縮.
4.2.3用蠟筆在血膜兩側(cè)劃線,以防染液溢出,然后將血膜平放在染色架上.加瑞氏染液2-3滴,使覆蓋整個血膜,固定0.5-1.0分鐘.滴加等量或稍多的新鮮蒸餾水,與染料混勻染色5-10分鐘.
4.2.4用清水沖去染液,待自然干燥后或用吸水紙吸干,即可置血涂片于顯微鏡下進行鏡檢。
4.2.5白細(xì)胞分類計數(shù)。
選擇涂片的體尾交界處染色良好的區(qū)域,在油鏡下計數(shù)100個紅細(xì)胞,按其形態(tài)特征進行分類計數(shù),求出各類細(xì)胞所占比值。
1.瑞氏染液:瑞氏染料1g加甲醇(AR)600ML。將瑞氏染料放在清潔干燥乳缽中,加少量甲醇,充分研磨使染料溶解.將已完全溶解的部分倒入棕色試劑瓶中,未溶解部分再加少量甲醇研磨,直至染料完全溶解于甲醇為止。新配制的染料偏堿,須在室溫和37℃下一定時間待染料成熟,主要美藍(lán)逐漸增多為天青B后才能使用.貯存時間越久染色效果越好,因此,Deamgilliland等采用吸光度比值(rA)作為瑞氏染料的質(zhì)量規(guī)格.rA測定方法如下:取瑞氏染液15-25ul(視染液濃度而定)加甲醇10ml稀釋,混勻后以甲醇為空白管分別以波長650nm,525nm比色,rA=A650/A525。因為美藍(lán)吸收峰為波長650nm,伊紅吸收峰波長為525nm,天青B吸收峰也為650nm,但吸光度A約為美藍(lán)的一半.所以新配制染料的RA接近2,隨著美藍(lán)逐漸氧化為天青B,RA也相應(yīng)下降,RA下降達(dá)1.3±0.1即可使用.瑞氏染料在貯存過程中必須塞嚴(yán),以防甲醇揮發(fā)和氧化為甲酸.有人主張配方中加入30ml甘油,防止甲酸揮發(fā),并可使細(xì)胞染色清晰.甲醇必須純凈,如甲醇中丙酮含量過多,染色偏酸,使細(xì)胞著色不良。磷酸鹽緩沖液(PH6.4-6.8)：磷酸二氫鉀0.3g加磷酸氫二鈉0.2g再加蒸餾水至1000ml,配制成磷酸鹽緩沖液調(diào)整PH,如無緩沖液可用新鮮蒸餾水代替?！ ?/p>
血涂片-白細(xì)胞分類計數(shù)正常參考值
細(xì)胞類別成人
桿狀核0.01-0.05
分葉核0.50-0.70
嗜酸性粒細(xì)胞0.005-0.05
嗜堿性粒細(xì)胞0-0.01
淋巴細(xì)胞0.20-0.40
單核細(xì)胞0.03-0.08
血涂片-附注
1要避免重復(fù)計數(shù),玻片應(yīng)由血膜邊緣向中央依次上下呈曲線移動.
2白細(xì)胞總數(shù)超過20×109/L,應(yīng)分類計數(shù)200個細(xì)胞,白細(xì)胞數(shù)明顯減少的血片,可檢查多張血片?！ ?/p>
血涂片-注意事項
1) 玻片的清洗：新玻片常有游離堿質(zhì),因此應(yīng)用清洗液或10%鹽酸浸泡24小時,然后再徹底清洗。用過的玻片可放入適量肥皂水或合成洗滌劑的清水中煮沸20分鐘,再用熱水將肥皂和血膜洗去,用自來水反復(fù)沖洗,必要時再置95%乙醇中浸泡1小時,然后擦干或烤干備用。使用玻片時只能手持玻片邊緣,切勿觸及玻片表面;,以保持玻片清潔,干燥,中性、無油膩。
2) 細(xì)胞染色對氫離子濃度十分敏感,在染色過程中玻片必須化學(xué)清潔,配制瑞氏染液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇,稀釋染液必須用緩沖液,沖洗用水應(yīng)近中性,否則各種細(xì)胞染色反應(yīng)異常,致使細(xì)胞的識別困難,甚至造成錯誤。
3) 一張良好的血片,要求厚薄適宜,頭體尾分明,分布均勻,邊緣整齊,兩側(cè)留有空隙。血片制好后最好立即固定染色,以免細(xì)胞溶解和發(fā)生退行性變。
4) 血膜未干透,細(xì)胞尚未牢固附在玻片上,在染色過程中容易脫落,因此血膜必需充分干燥.
5) 染色時間與染液濃度,室溫高低,細(xì)胞多少有關(guān).染液越淡,室溫越低,細(xì)胞越多,所需染色時間越長或應(yīng)適當(dāng)增加染液量,因此染色時間應(yīng)視具體情況而定.特別是更換新染料時必須經(jīng)試染,摸索最佳染色條件.
6) 染液不可過少,以防蒸發(fā)干燥染料沉著于血片上難沖洗干凈.
7) 沖洗時應(yīng)用流水將染液沖去.不能先倒掉染液,以免染料沉著于血片上.
8) 染色過深可用甲醇或酒精適當(dāng)脫色,最好不復(fù)染,必須復(fù)染時,可將染液先稀釋好再復(fù)染.
9) 染色時應(yīng)注意保護血膜尾部細(xì)胞,不能劃掉.因為體積較大細(xì)胞常在此處出現(xiàn).
血涂片-染色結(jié)果
在正常情況下血膜外觀為粉紅色,在顯微鏡下紅細(xì)胞呈肉紅色；白細(xì)胞胞漿能顯示各種細(xì)胞的特有色彩,細(xì)胞核染紫紅色,染色質(zhì)清楚,粗細(xì)松緊可辨。染色結(jié)果偏酸,則紅細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞顆粒偏紅,白細(xì)胞核呈淺藍(lán)色或不著色；染色結(jié)果偏堿,則所有細(xì)胞染成灰藍(lán)色,顆粒深暗，嗜酸性顆?？扇境砂岛稚?甚至紫黑色或藍(lán)色。嗜中性顆粒偏粗,偏堿(紫黑色).血片原處呈綠色.
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