組織學(xué)/一般光學(xué)顯微鏡術(shù)

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組織學(xué)

組織學(xué)緒論
- 組織學(xué)研究方法
  - 一般光學(xué)顯微鏡術(shù)
  - 幾種特殊顯微鏡的應(yīng)用
  - 組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)術(shù)
  - 免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)
  - 同位素示蹤術(shù)
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  - 細(xì)胞融合術(shù)

應(yīng)用一般光學(xué)顯微鏡（簡稱光鏡）觀察組織切片是組織學(xué)研究的最基本方法。取動物或人體的新鮮組織塊，先用固定劑（fixative）固定（fixation），使組織中的蛋白質(zhì)迅速凝固，防止細(xì)胞自溶和組織腐敗。常用的固定劑如酒精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化鋨等，一般常將幾種固定劑配制成混合固定液，以抵消或減弱單種固定劑對組織的收縮或膨脹等缺點，達(dá)到更好固定效果。固定后的組織塊（約3～5mm³大小）用石蠟、火棉膠或樹脂等包埋（embedding）成硬塊，以切片機（microtome）切成5～10μm厚的組織切片（tissue section），切片貼在載玻片上經(jīng)脫蠟等步驟后進(jìn)行染色。組織塊也可立即投入液氮（－196℃）內(nèi)快速凍結(jié)，用恒冷箱切片機（cryostat）制成冷凍切片（frozen section），這種方法制片迅速，細(xì)胞內(nèi)酶活性保存較好，常用于酶組織化學(xué)染色。血細(xì)胞和分離培養(yǎng)的細(xì)胞可直接涂在玻片上，制成涂片（smear）。疏松結(jié)締組織和腸系膜等軟組織可撕成薄片鋪在玻片上（鋪片），牙和骨等堅硬組織可磨成薄片（磨片）。組織切片等標(biāo)本經(jīng)染色、透明后，以封固劑和蓋片封固，即可長期保存，鏡下觀察。

堅牢綠（酸性染料）與亞甲藍(lán)（堿性染料）的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其染色反應(yīng)示意

圖1－1　堅牢綠（酸性染料）與亞甲藍(lán)（堿性染料）的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其染色反應(yīng)示意

染色（staining）是用染料使組織切片著色，便于鏡下觀察。天然和人工合成的染料甚多,它們都是含發(fā)色團的有機化合物，當(dāng)染料具有助色團成為鹽類物質(zhì)，即可溶解于水并具電荷，與組織有親合力，使組織著色。含氨基（－NH₂）、二甲氨基〔－N（CH₃）₂〕等堿性助色團的染料，稱堿性染料（basic dye），它的鹽溶液具陽電荷；含羧基（－COOH）、羥基（－OH）或磺基（－SO₃H）等酸性助色團的染料，稱酸性染料（acid dye），它的溶液具陰電荷（圖1－1）。組織的染色原理一般認(rèn)為基于化學(xué)結(jié)合或物理吸附作用。細(xì)胞和組織的酸性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)與堿性染料親合力強者，稱嗜堿性（basophilia）；而堿性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)與酸性染料親合力強者，稱嗜酸性（acidophilia）；若與兩種染料的親合力均不強者，稱中性(neutrophilia)。組織的基本成分是蛋白質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸常是即有含氨基的，也有含羧基的，是兩性電解質(zhì)。各種蛋白質(zhì)的等電點因氨基酸成分的不同而異，其電荷性質(zhì)又與溶液的pH值相關(guān)，根據(jù)研究目的選用合適的染色方法，調(diào)整好染液的pH值，即可取得良好染色效果。常用的酸性染料如伊紅、堅牢綠、橙黃G等，堿性染料如蘇木精、亞甲藍(lán)、堿性品紅等。組織學(xué)中最常用的是蘇木精（hematoxylin）和伊紅（eosin）染色法，簡稱HE染色法。蘇木精使細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)的嗜堿性物質(zhì)著藍(lán)紫色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)的膠原纖維等著紅色。

物理吸附作用的染色方法，如用蘇丹染料顯示脂肪組織，染料溶于脂肪內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的脂滴顯色。又如用硝酸銀、氯化金等重金屬鹽顯示細(xì)胞和組織的某些結(jié)構(gòu)，則是使金屬微粒附著在結(jié)構(gòu)表面而呈棕黑色或棕黃色。銀染法中有些組織結(jié)構(gòu)可直接使硝酸銀還原而顯示，稱此為親銀性（argentaffin）；有些結(jié)構(gòu)無直接還原作用，需加入還原劑方能顯色，則稱為嗜銀性（argyrophilia）。還有些組織成分如結(jié)締組織和軟骨基質(zhì)中的糖氨多糖，當(dāng)用甲苯胺藍(lán)（toluidine blue）等堿性染料染色后呈紫紅色，這種現(xiàn)象稱為異染性(metachromasia)，其原理可能是該染料在溶液中呈單體狀態(tài)時顯藍(lán)色，當(dāng)它與多陰離子的高分子物質(zhì)耦合后，染料分子聚合成多聚體而顯紅色（圖1－2）。還有些染色方法的原理至今還不清楚。

異染性示意圖