石蠟切片
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石蠟切片（paraffin section） 組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。教學(xué)中，光鏡下觀察切片標(biāo)本多數(shù)是石蠟切片法制備的。活的細(xì)胞或組織多為無色透明，各種組織間和細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區(qū)別出；組織離開機(jī)體后很快就會死亡和產(chǎn)生組織腐敗，失去原有正常結(jié)構(gòu)，因此，組織要經(jīng)固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細(xì)胞組織死亡，而能清晰辨認(rèn)其形態(tài)結(jié)構(gòu)。
石蠟切片制作基本技術(shù)
石蠟切片法包括取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與粘片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟。一般的組織從取材固定到封片制成玻片標(biāo)本需要數(shù)日，但標(biāo)本可以長期保存使用，為永久性顯微玻片標(biāo)本。
1.取材 應(yīng)根據(jù)要求選取材料來源及部位。例如植物細(xì)胞有絲分裂多選取洋蔥根尖，細(xì)胞分裂快又便于切??；豬的肝小葉邊界清晰明確；耳蝸以豚鼠的內(nèi)耳易于定位和剝離。材料必須新鮮，擱置時間過久則產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解變性，導(dǎo)致細(xì)胞自溶及細(xì)菌的滋生，而不能反映組織活體時的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
2.固定 用適當(dāng)?shù)?a href="/w/%E5%8C%96%E5%AD%A6" title="化學(xué)">化學(xué)藥液——固定液浸漬切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細(xì)胞和組織中的物質(zhì)成分、終止細(xì)胞的一切代謝過程、防止細(xì)胞自溶或組織變化，盡可能保持其活體時的結(jié)構(gòu)。固定能使組織硬化，有利于切片的進(jìn)行，而且也有媒浸作用，有利于組織著色。固定液的種類很多，其對組織的硬化收縮程度以及組織內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì)的作用各不相同。例如純酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般組織，但溶解肝糖和色素。固定液可分為單一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蟻醛、福爾馬林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、鋨酸（四氧化鋨）、重鉻酸鉀及苦味酸等，單一固定液不能固定細(xì)胞中的所有成分；混合固定液可以互補(bǔ)不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方見有關(guān)技術(shù)書籍）。因此，應(yīng)根據(jù)所要顯示的內(nèi)容來選擇適宜的固定液。10％福爾馬林（4％甲醛）或10％磷酸緩沖福爾馬林是病理切片常規(guī)使用的固定液，不僅適用于常規(guī)HE（蘇木精-伊紅）染色，還可以用于組織學(xué)有關(guān)的其他技術(shù)的切片染色。固定液的用量通常為材料塊的20倍左右，固定時間則根據(jù)材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以從1小時至數(shù)天，通常為數(shù)小時至24小時。
3.洗滌與脫水 固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會影響以后的染色效果。多數(shù)用流水沖洗；使用含有苦味酸的固定液固定的則需用酒精多次浸洗；如果組織經(jīng)酒精或酒精混合液固定，則不必洗滌，可直接進(jìn)行脫水。固定后或洗滌后的組織內(nèi)充滿水分，如不除去水分就無法進(jìn)行以后的透明、浸蠟與包埋，因為透明劑多數(shù)是苯類，苯類和石蠟均不能與水相融合，水分不脫盡，苯類不能浸入。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混，為了減少組織材料的急劇收縮，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行，通常從30％或50％酒精開始，經(jīng)70％、85％、95％直至純酒精（無水乙醇），每次時間為1～數(shù)小時，如不能及時進(jìn)行各級脫水，材料可以放在70％酒精中保存，因高濃度酒精易使組織收縮硬化，不宜處理過久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環(huán)等也可做脫水劑。
4.透明 純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。通常組織先經(jīng)純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1～2小時，再轉(zhuǎn)入純透明劑中浸漬。透明劑的浸漬時間則要根據(jù)組織材料塊大小及屬于囊腔抑或?qū)嵸|(zhì)器官而定。如果透明時間過短，則透明不徹底，石蠟難于浸入組織；透明時間過長，則組織硬化變脆，就不易切出完整切片，最長為數(shù)小時。
5.浸蠟與包埋 用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時，再先后移入2個熔化的石蠟液中浸漬3小時左右，浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點3℃左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。浸蠟后的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中（擺好在蠟中的位置），待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷卻，即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框盒。如果包埋的組織塊數(shù)量多，應(yīng)進(jìn)行編號，以免差錯。石蠟熔化后應(yīng)在蠟箱內(nèi)過濾后使用，以免因含雜質(zhì)而影響切片質(zhì)量，且可能損傷切片刀。通常石蠟采用熔點為56～58℃或60～62℃兩種，可根據(jù)季節(jié)及操作環(huán)境溫度來選用。
6.切片 包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的四棱臺，以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于小木塊上，夾在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)的蠟塊鉗內(nèi)，使蠟塊切面與切片刀刃平行，旋緊。切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可用熱水或冷水等方法適當(dāng)改變蠟塊硬度。通常切片厚度為4～7微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。
7.貼片與烤片 用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步驟中二者滑脫開。粘附劑是蛋白甘油。首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油，再將一定長度蠟帶（連續(xù)切片）或用刀片斷開成單個蠟片于溫水（45℃左右）中展平后，撈至玻片上鋪正，或直接滴兩滴蒸餾水于載玻片上，再把蠟片放于水滴上，略加溫使蠟片鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入45℃溫箱中干燥，也可在37℃溫箱中干燥，但需適當(dāng)延長時間。
8.切片脫蠟及水化 干燥后的切片需脫蠟及水化才能在水溶性染液中進(jìn)行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。如果染料配制于酒精中，則將切片移至與酒精近似濃度時，即可染色。
9.染色 染色的目的是使細(xì)胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色以便于觀察。未經(jīng)染色的細(xì)胞組織其折光率相似，不易辨認(rèn)。經(jīng)染色可顯示細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器及內(nèi)含物以及不同類型的細(xì)胞組織。染色劑種類繁多，應(yīng)根據(jù)觀察要求及研究內(nèi)容采用不同的染色劑及染色方法，還要注意選用適宜的固定劑才能取得滿意的結(jié)果。經(jīng)典的蘇木精（Hematoxylin）和伊紅（曙紅，Eosin）染色法是組織學(xué)標(biāo)本及病理切片標(biāo)本的常規(guī)染色，簡稱HE染色。經(jīng)HE染色后，細(xì)胞核被蘇木精染成紫藍(lán)色，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)及非細(xì)胞成分被伊紅染成粉紅色。由于蘇木精是帶陽離子的染料，染液呈堿性，核內(nèi)染色質(zhì)及胞質(zhì)內(nèi)核糖體等物質(zhì)對這種染料有親和性，稱嗜堿性；而帶陰離子的染料伊紅配制的染液呈酸性，對這種染料的親和性，稱嗜酸性。有時不同的組織結(jié)構(gòu)還需要用特殊的染料及染色方法加以顯示，稱特殊染色。有些細(xì)胞組織經(jīng)硝酸銀浸潤后，可使溶液中銀離子還原成金屬銀或銀粒附著在細(xì)胞組織上，呈棕黑色，這種性質(zhì)稱親銀性，而有些細(xì)胞組織本身不能使硝酸銀的銀離子還原成金屬銀，還需加還原劑才能將銀離子還原，稱嗜銀性。
10.切片脫水、透明和封片 染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經(jīng)梯度酒精脫水，在95％及純酒精中的時間可適當(dāng)加長以保證脫水徹底；如染液為酒精配制，則應(yīng)縮短在酒精中的時間，以免脫色。二甲苯透明后，迅速擦去材料周圍多余液體，滴加適量（1～2滴）中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現(xiàn)氣泡，封片后即制成永久性玻片標(biāo)本，在光鏡下可長期反復(fù)觀察。注意有些染料需特定廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品。根據(jù)各種染色方法、組織類別及切片厚度，掌握適宜的染色時間，才能達(dá)到較好的染色效果。
石蠟制片程序及環(huán)節(jié)繁多，需數(shù)日才能完成1個周期，但切片可長期保存，供教學(xué)、科研及病理診斷及復(fù)察，并可利用蠟塊作其他項目的回顧性研究。病理常規(guī)制片過程中已簡化了一些細(xì)的環(huán)節(jié)或縮短了部分處理時間以適應(yīng)臨床需要（可縮短至2天）。雖然冰凍切片大大快于石蠟切片，但所顯示的形態(tài)結(jié)構(gòu)卻不如前者，因此病理醫(yī)生最后還需要根據(jù)石蠟切片作出準(zhǔn)確診斷。近些年來，在病理常規(guī)制片過程中采用了微波技術(shù)，從而大大縮短了制片過程，而且對形態(tài)結(jié)構(gòu)并沒有影響。微波是一種波長很短、頻率卻很高的高頻電磁波［波長為1米 ～1毫米，頻率為300兆赫（MHz）～300千兆赫（GHz）］。組織經(jīng)微波輻射后加速組織內(nèi)部分子的高速運動，以使液體的運輸加快，增加彌散、滲透和交換效率，從而加速組織的固定、脫水、透明、包埋和染色各個環(huán)節(jié)。例如常規(guī)福爾馬林固定需數(shù)小時～1天，而且能引起組織收縮及某些抗原成分不同程度的受到破壞，微波固定僅需1～2分鐘，且可減少抗原的丟失和損害。選擇適當(dāng)?shù)臋n次（功率）、輻射時間和溫度是極為重要的。目前微波技術(shù)的應(yīng)用在國內(nèi)尚處于起步階段，許多技術(shù)應(yīng)用環(huán)節(jié)尚需進(jìn)一步摸索。
石蠟切片與其他技術(shù)方法的結(jié)合 石蠟切片雖然是經(jīng)典的方法，但又是最基本的方法，它與其他新的技術(shù)方法相結(jié)合，使傳統(tǒng)的老技術(shù)擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，開辟了許多新領(lǐng)域，增加了許多新的研究、觀察內(nèi)容。隨新的儀器及新的研究技術(shù)的不斷問世及使用，使組織學(xué)的觀察研究從簡單的形態(tài)結(jié)構(gòu)深入到各種成分的定性觀察，又從定性轉(zhuǎn)向定量計測，使細(xì)胞組織的形態(tài)，功能及代謝三結(jié)合，從而達(dá)到定性可靠、定位準(zhǔn)確及定量可測?！ ?/p>
與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合
組織制片技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合構(gòu)成免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，檢測組織切片中細(xì)胞組織的多肽及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的定性和定位觀察研究。不論哪種免疫組織化學(xué)技術(shù)都包括抗體的制備、組織材料處理、制備玻片標(biāo)本以及免疫染色。冰凍切片手續(xù)簡便，制片過程中抗原活性丟失少，但組織細(xì)胞形態(tài)較差；石蠟切片步驟繁多，制片中抗原活性有所減低，但組織細(xì)胞形態(tài)清晰，是免疫組織化學(xué)常規(guī)制備切片方法之一。一般石蠟包埋的組織切片用于檢測胞漿或核內(nèi)的抗原，不宜做表面抗原染色，有人將新鮮組織浸泡于冷磷酸緩沖液內(nèi)48小時，再固定于96％乙醇或其他固定液固定的組織切片，可用于表面抗原染色。乙醇、丙酮等固定劑對抗原破壞較輕，但結(jié)構(gòu)保存較差。最常用的固定液有中性和緩沖福爾馬林，它可與蛋白質(zhì)交叉結(jié)合封閉抗原，在進(jìn)行免疫染色前，切片再用蛋白酶消化，以暴露抗原部位、增強(qiáng)抗原的反應(yīng)。在石蠟切片上進(jìn)行的常用的免疫組化染色有免疫酶組織化學(xué)技術(shù)中的PAP法（非標(biāo)記過氧化物酶-抗過氧化物酶法）及親和免疫組織化學(xué)技術(shù)中的ABC法（抗生物素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)），其特異性強(qiáng)、敏感性高。使用兩種染色法的組織切片都需先經(jīng)第一抗體（各種抗血清）孵育；再經(jīng)第二抗體或生物素標(biāo)記的第二抗體孵育；后經(jīng)PAP復(fù)和物或ABC復(fù)合物孵育，最后以DAB（二氨基聯(lián)苯胺）-H2O2液顯色呈棕黃色沉淀。常規(guī)復(fù)染、脫水、透明、封片成永久性玻片標(biāo)本，光鏡下檢測常規(guī)或特殊染色法難以顯示的成分及其精確定位，可用于基礎(chǔ)研究及臨床病理研究及診斷。微波用于石蠟包埋切片免疫組織化學(xué)染色既簡化步驟又節(jié)省時間，且能促進(jìn)免疫染色效果。
石蠟包埋組織流式細(xì)胞儀DNA含量分析 是石蠟包埋組織切片與流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）結(jié)合使用來測量DNA含量及倍體分析，這一結(jié)合是流式細(xì)胞儀在臨床應(yīng)用中，特別是在腫瘤研究方面開拓了新的研究途徑。FCM是激光、電子和電子計算機(jī)、流體噴射技術(shù)的綜合發(fā)展應(yīng)用，是快速定量分析細(xì)胞的技術(shù)，要求被檢細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。目前已可測量細(xì)胞的大小、體積、DNA含量、DNA合成速率、RNA含量、表面抗原、染色體等。由于制備樣品技術(shù)的原因，過去許多流式分析資料僅限于采用新鮮組織標(biāo)本，Hedley等1983年首先報導(dǎo)了FCM分析石蠟包埋組織切片制備分散細(xì)胞懸液技術(shù)來進(jìn)行DNA含量的檢測，從組織切片中能獲得足夠數(shù)量的單個細(xì)胞，且與新鮮組織分離獲得的單個細(xì)胞在形態(tài)及DNA含量組方圖上均極為相似。目前國內(nèi)也在逐步開展這方面的研究。由于這種方法取材可在病理組織觀察或診斷基礎(chǔ)上進(jìn)行，比活檢或手術(shù)切除標(biāo)本更為準(zhǔn)確，又可做回顧性研究分析；且對DNA檢測速度快、數(shù)據(jù)客觀可靠，在腫瘤診斷、預(yù)后的預(yù)測和治療反應(yīng)上具有重要價值；利用過去的標(biāo)本可成批制作細(xì)胞懸液、成批上機(jī)測試，避免了儀器調(diào)試狀態(tài)不同帶來的影響，石蠟包埋塊保存時間的長短對結(jié)果影響不大。
常規(guī)固定（多數(shù)用福爾馬林）、石蠟包埋的組織塊均可用于流式細(xì)胞術(shù)，但含苦味酸或汞的固定液均不宜使用。切片厚度以30～50微米為宜。切片脫蠟要干凈、徹底，否則制備出的細(xì)胞懸液中碎片多，影響測定。梯度酒精水化后用胃蛋白酶或胰蛋白酶消化，消化后鏡檢呈單個分散狀態(tài)；由于福爾馬林固定可使DNA和核蛋白產(chǎn)生共價交聯(lián)，影響DNA和染料的化學(xué)定量結(jié)合，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，蛋白酶可破壞其聯(lián)結(jié)，改善測定的組方圖質(zhì)量，消化時間以能分散細(xì)胞及細(xì)胞碎片盡量少為適度，以100目尼龍篩網(wǎng)濾去未消化完的組織片，離心去上清液后，加入冰冷的70％酒精固定，放入4℃冰箱備用。上機(jī)前染色。DNA特異熒光染料主要有：（1）碘化丙錠（PI）；（2）溴化乙錠（EB）；（3） 4，6-二脒基-二苯基吲哚（DAPI）。FCM檢測石蠟包埋組織細(xì)胞DNA含量可做為以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，多參數(shù)綜合診斷中的一個重要的新手段。由于儀器設(shè)備價格昂貴及制備樣品的諸多環(huán)節(jié)均可能影響測定的數(shù)據(jù)，限制了臨床的廣泛使用。
石蠟切片標(biāo)本是形態(tài)計量技術(shù)的基礎(chǔ) 形態(tài)計量技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新的定量檢測技術(shù)，用全自動圖像分析儀對組織和細(xì)胞內(nèi)各種有形成分的數(shù)量、體積、長度及表面積等的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，以便對生物組織細(xì)胞及其結(jié)構(gòu)成分的形態(tài)進(jìn)行定量分析，如線粒體個數(shù)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核及胞質(zhì)面積、胰島的數(shù)量及各類細(xì)胞的數(shù)值、腎小體的數(shù)量和體積比以及Feulgen染色測定細(xì)胞核DNA原位定量等，使組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)的研究由形態(tài)及定性觀察轉(zhuǎn)向形態(tài)定量化。形態(tài)計量是從石蠟組織切片或涂片以及組織的光鏡照片和電鏡照片上的各種結(jié)構(gòu)獲取二維圖像數(shù)據(jù)，通過軟件程序處理，得出有價值的結(jié)構(gòu)參數(shù)。這種數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高、客觀性強(qiáng)、重復(fù)性好、可減少或彌補(bǔ)觀察者的主觀性差異。形態(tài)計量已應(yīng)用于臨床病理診斷工作，包括非腫瘤病變與腫瘤病變。國內(nèi)對非腫瘤性病變的研究已涉及到動脈粥樣硬化、肝硬變、前列腺肥大、克汀病、胰腺炎及精索靜脈曲張等；而對腫瘤病變的研究則是形態(tài)計量學(xué)在臨床研究的重點，目前較集中于消化道、肝、膀胱、乳腺和肺等器官的腫瘤。此外，在疾病的發(fā)生過程中把形態(tài)計量參數(shù)與功能變化指標(biāo)有機(jī)地結(jié)合，有利于探討疾病的發(fā)病機(jī)制；形態(tài)計量參數(shù)對腫瘤病變的治療效果及預(yù)后判斷的估計亦有參考價值。
在形態(tài)計量學(xué)的研究中，首先是對樣品質(zhì)量要求較高，例如制片過程中組織的收縮、膨脹與擠壓、切片厚度與方向，特別是切片染色技術(shù)，染色是使組織或細(xì)胞各成分能染成不同色澤而便于識別，提高待測成分圖像的可測性及其內(nèi)在組分的表達(dá)性，使待測成分的色彩和亮度明顯清晰地區(qū)別于它的背景。采用常規(guī)染色、特殊染色以及免疫組織化學(xué)染色，可對不同著色的成分及反應(yīng)物作形態(tài)定量測定；利用免疫組織化學(xué)和原位雜交技術(shù)使病灶染色，再作形態(tài)定量測量。其次是要找出特征結(jié)構(gòu)參數(shù)或定量指標(biāo)，可先檢測組織或細(xì)胞的各種可測參數(shù)或根據(jù)待測成分的形態(tài)特點設(shè)計一些參數(shù)，再用統(tǒng)計學(xué)方法篩選出有用的參數(shù)作定量測定。由于儀器昂貴，目前國內(nèi)尚處在實驗研究階段，臨床上的廣泛應(yīng)用尚有一定困難。形態(tài)計量技術(shù)與常規(guī)技術(shù)和其它新技術(shù)綜合研究方法的使用，具有較好的應(yīng)用價值及效果。
隨著各種新儀器的問世和新技術(shù)方法的不斷建立與使用，石蠟切片技術(shù)也逐漸擴(kuò)展、滲入許多新領(lǐng)域中，做為基礎(chǔ)技術(shù)提供有效的實驗或使用樣品。石蠟包埋組織切片還可用于細(xì)胞原位核酸分子雜交技術(shù)中，可對材料中被雜交的DNA分子進(jìn)行定位、含量分析或觀察基因表達(dá)（mRNA）水平；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)可用于固定、石蠟包埋組織的DNA分析，使研究進(jìn)入了分子水平，但在短期內(nèi)這些技術(shù)尚不能做常規(guī)使用。
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