化學(xué)發(fā)光免疫分析儀
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化學(xué)發(fā)光免疫分析儀包含兩個(gè)部分, 即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體, 當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí), 同時(shí)發(fā)射出光子(hM) , 利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體) 直接標(biāo)記在抗原(化學(xué)發(fā)光免疫分析) 或抗體(免疫化學(xué)發(fā)光分析) 上, 或酶作用于發(fā)光底物。
化學(xué)發(fā)光免疫分析法以標(biāo)記方法的不同而分為兩種:
(1)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法;
(2)酶標(biāo)記、以化學(xué)發(fā)光底物作信號(hào)試劑的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法
化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CL IA ) ,是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物——acridin ium ester (A E) ,是有效的發(fā)光標(biāo)記物[ 3 ] , 其通過起動(dòng)發(fā)光試劑(N aOH2H2O 2 ) 作用而發(fā)光, 強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成,為快速的閃爍發(fā)光(見圖1)。吖啶酯作為標(biāo)記物用于免疫分析, 其化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、無須催化劑; 檢測(cè)小分子抗原采用競(jìng)爭(zhēng)法 ,大分子抗原則采用夾心法 , 非特異性結(jié)合少, 本底低; 與大分子的結(jié)合不會(huì)減小所產(chǎn)生的光量, 從而增加靈敏度。
從標(biāo)記免疫分析角度, 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,CL E IA ) , 應(yīng)屬酶免疫分析, 只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑,操作步驟與酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體) 進(jìn)行免疫反應(yīng), 免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,在信號(hào)試劑作用下發(fā)光, 用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP) 和堿性磷酸酶(AL P) ,它們有各自的發(fā)光底物。
HRP 標(biāo)記的CLEIA常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲酰肼,lum ino l) ,或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲酰肼) , 是一類重要的發(fā)光試劑。其結(jié)構(gòu)如圖4 所示。魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行,在過氧化物酶及活性氧[ 過氧化陰離子(O 2- ) , 單線態(tài)氧(1O 2 ) , 羥自由基(OH.) , 過氧化氫(H2O 2)]存在下,生成激發(fā)態(tài)中間體, 當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光, 其波長(zhǎng)為425nm。
早期用魯米諾直接標(biāo)記抗原(或抗體) ,但標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標(biāo)記抗體, 進(jìn)行免疫反應(yīng)后利用魯米諾作為發(fā)光底物, 在過氧化物酶和起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH2H2O 2) 作用下, 魯米諾發(fā)光, 發(fā)光強(qiáng)度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。Kodak Am erliteTM半自動(dòng)分析系統(tǒng)就是利用這一體系專門設(shè)計(jì)的。
增強(qiáng)發(fā)光酶免疫分析(enhanced lum ines2cence enzym e imm unoassay, ELEIA )在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑, 如對(duì)2碘苯酚等, 以增強(qiáng)發(fā)光信號(hào),并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定, 便于重復(fù)測(cè)量, 從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。在全自動(dòng)分析儀上, 還可通過計(jì)算機(jī)嚴(yán)密控制, 進(jìn)行自動(dòng)操作, 如加試劑,混合, 溫育, 洗滌, 加發(fā)光試劑, 發(fā)光計(jì)數(shù), 數(shù)據(jù)處理, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 直至完成病人血清樣品的分析并打印出結(jié)果。Am erliteTM發(fā)光增強(qiáng)酶免分析系統(tǒng)用熒光素、噻唑等增強(qiáng)劑, 其發(fā)光時(shí)間可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)20m in, 試劑盒有甲狀腺功能檢測(cè)的
促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、游離甲狀腺素, 與性激素有關(guān)的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。
ALP標(biāo)記的CLEIA所用底物為環(huán)1, 22二氧乙烷衍生物, 這是一類很有前途的發(fā)光底物 ,用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的基團(tuán)——金剛烷基, 其分子中發(fā)光基團(tuán)為芳香基團(tuán)和酶作用的基團(tuán),在酶及起動(dòng)發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 sp iroadam an2tane ) 42methoxy242( 3’2 pho spho ryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名為: 32(2’2螺金剛烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22環(huán)二氧乙烷)。在堿性磷酸酶(AL P) 作用下,磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個(gè)磷酸基, 得到一個(gè)中等穩(wěn)定的中間體AM PD (半壽期為2～ 30m in) ,此中間體經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子, 當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生470nm 的光,可持續(xù)幾十分鐘。AM PPD 為磷酸酯酶的直接化學(xué)發(fā)光底物,可用來檢測(cè)堿性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結(jié)合物?？蓹z測(cè)到堿性磷酸酯酶的濃度為10- 15mo l?L 。
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