免疫印跡法
| A+醫(yī)學百科 >> 免疫印跡法 |
免疫印跡法 (Western blotting) 是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優(yōu)點，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達與分布的一種最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質(zhì)量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。
免疫印跡法(immunobiotting test,IBT)亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(enzyme linked
immunoelectrotransfer blot,EITB),因與Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法 Southern
blot 相類似,亦被稱為Western-blot.
免疫印跡法分三個階段進行.第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE):抗原等蛋白
樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷,在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動,分子量越小,泳動速度就越
快.此階段分離效果肉眼不可見(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶).第二階段為電轉(zhuǎn)移:將在凝膠
中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,選用低電壓(100V)和大電流(1～2A),通電45min
轉(zhuǎn)移即可完成.此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見.第三階段為酶免疫定位:將印有蛋白質(zhì)條
帶的硝酸纖維素膜(相當于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后,加
入能形成不溶性顯色物的酶反應底物,使區(qū)帶染色.常用的HRP底物為3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(呈
棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍紫色).陽性反應的條帶清晰可辨,并可根據(jù)SDS-PAGE時加入的分子
量標準,確定各組分的分子量.本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性,
是一個有效的分析手段,不僅廣泛應用于分析抗原組分及其免疫活性,并可用于疾病的診斷.在艾
滋病病毒感染中此法作為確診試驗.抗原經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后,將膜切成小條,配合酶
標抗體及顯色底物制成的試劑盒,可方便地在實驗室中供檢測用.根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可判斷
有無針對病毒的特異性抗體.
免疫印跡法
免疫印跡法 是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。
一、原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
二、試劑準備
1、SDS-PAGE試劑:見電泳實驗。
2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。
6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0μl。
三、操作步驟
（一）蛋白質(zhì)樣品獲得：細菌誘導表達后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
（二）電泳：制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。
（三）轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）
1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。
2、膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。
3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對比。
（四）免疫反應：
1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。
2、加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2hr。
3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。
5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。
6、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2hr。
7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
8、加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應。
四、注意事項
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預實驗確定最佳條件。
2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。
3、DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。
| 關(guān)于“免疫印跡法”的留言： |  訂閱討論RSS
|
|
目前暫無留言 | |
| 添加留言 | |